一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理，(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线，(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种亚单位流感疫苗中裂解剂的检测方法，特别是使用高效液相色谱检测方法。
技术介绍
壬苯醇醚-9是一种非离子型表面活性剂，其化学名称为NonylphenylPolyethylene Glycol Ether。在亚单位流感疫苗生产过程中，需加入裂解剂壬苯醇醚-9，对全病毒进行裂解，再经纯化，得到亚单位疫苗。由于非离子性表面活性剂对细胞膜的侵害性，因此疫苗中的裂解剂残留量必须严格控制在一定的安全限量标准之内。以往国内报道过比色法测定裂解剂的方法，但是此方法受方法学限制，不是直接反映裂解剂含量，具有一定误差。
技术实现思路
本专利技术提供一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的检测方法，该方法包括以下步骤(I)待检亚单位流感疫苗样品的处理，(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线，(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量；其中步骤(I)和步骤⑵之间，以及步骤⑵和步骤⑶之间的顺序可以互换；其特征在于，HPLC检测采用的色谱柱是C4柱。本专利技术的检测方法，其特征在于HPLC检测采用的色谱柱是ThermoBioBasic_4C4柱。本专利技术的检测方法，其特征在于步骤(I)的待检亚单位流感疫苗样品的处理方法为用4倍体积的甲醇沉淀后上清液作为待测样品。本专利技术的检测方法，其特征在于HPLC检测时的紫外检测器的波长为275nm。本专利技术的的检测方法，其特征在于HPLC检测时采用体积比为80 20的甲醇/水作为流动相，流速lml/min。本专利技术的检测方法，其特征在于步骤I的沉淀温度为-20°C 65°C。本专利技术的检测方法，其特征在于步骤I的沉淀温度为37°C。本专利技术的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为22 37°C。本专利技术的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为33°C。优选的本专利技术的检测方法，该方法包括以下步骤(I)待检亚单位流感疫苗样品的处理取待检亚单位流感疫苗样品200 iil，加入800 ill甲醇，剧烈震荡30sec，37°C 30min, 14000rpm离心20min,吸取上清,0. 45um滤膜过滤,得到测试液；(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线精密称取标准品壬苯醇醚-9250 u g，用体积比为4 I的甲醇/水溶解定容至100ml,即得2500 u g/ml壬苯醇醚_9溶液,依次稀释定容为1000 u g/ml、50 u g/ml、50 u g/ml、25 u g/ml>5 u g/ml,按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚_9浓度对峰面积制作标准曲线；(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测步骤I得到的测试液用和制作标准曲线的同样条件进行HPLC测定，得到色谱图；(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量 其中HPLC 的色谱条件为色谱柱Thermo BioBasic_4C4 柱,4. 6mmX 150mm, 5 u m,定量环20iU，流动相体积比为80 20的甲醇7jC，流速lml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温33°C，上样量100u I0本专利技术的检测方法，是根据以下实验进行设计的，I.材料与方法I. I仪器和药品Hitachi L-2000高效液相色谱仪，L-2400紫外检测器，L-2130泵，EZSTART色谱工作站；Mettler Toledo AL 204 电子天平；Beckman Coulter Microfuge 22R 台式高速离心机。裂解剂标准品壬苯醇醚-9 ;甲醇为色谱纯；水为Milli-Q(Millipore)超纯水机制备，电阻率18. 2MQ cm。I. 2色谱条件色谱柱ThermoBioBasic_4C4 柱(4. 6mmX 150mm, 5 u m),定量环20ul,流动相甲醇7jC (80 20, v/v)，流速紫外检测器检测波长275nm，柱温:33°C，上样量IOOul。I. 3亚单位流感疫苗处理方法取亚单位流感疫苗200ul，加入800ul甲醇，剧烈震荡30sec，37°C 30min, 14000rpm离心20min,吸取上清,0. 45um滤膜过滤，HPLC分析。I. 4专属性实验取灭活流感病毒提取液，不加裂解剂，超声20min后按I. 3方法处理后HPLC测定。I 5标准曲线的制备精密称取标准品250iig，用甲醇/水(4 : 1，v/v)溶解定容至100ml，即得2500 V- g/ml 壬苯醇醚-9 溶液，依次稀释定容为 1000 u g/ml, 250 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 5 u g/ml,按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚_9浓度对峰面积制作标准曲线。I. 6回收率测定I. 6. I壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率取灭活流感病毒提取液，加入壬苯醇醚-9PB溶液，使终浓度达6000 U g/ml，混匀，40C 16小时(过夜)，依次进行5倍，25倍稀释，三个浓度分别按I. 3方法处理后测定回收率。I. 6. 2壬苯醇醚-9在亚单位流感疫苗中的回收率取亚单位流感疫苗，加入一定量壬苯醇醚_9，按I. 3方法处理后测定回收率。I. 7精密度测定I. 7. I日内精密度取各浓度标准品溶液和亚单位流感疫苗连续进样五针，以峰面积计算相对标准偏差(RSD% )0I. 7. 2日间精密度取各浓度标准品溶液和亚单位流感疫苗连续五天进样，以峰面积计算相对标准偏差(RSD % )。I. 8检测限和定量限 以十倍信噪比为最低检测限，以日内精密度和日间精密度均小于3%为定量限。2.结果2. I色谱谱图250 u g/ml壬苯醇醚_9甲醇/水标准品溶液保留时间(RT)为3. 300min,理论塔板数为2702，谱图见图I。专属性实验谱图见图2。回收率测定I中5倍稀释病毒裂解液保留时间(RT)为3. 307min,理论塔板数为2314，谱图见图3。回收率测定2中壬苯醇醚-9，亚单位流感疫苗及壬苯醇醚-9加亚单位流感疫苗的谱图分别见图4，图5，图6，亚单位流感疫苗中的保留时间(RT)为3. 280min，理论塔板数为2524。2. 2专属性实验由谱图可知，在壬苯醇醚-9出峰时间内，经过甲醇沉淀处理的灭活全病毒提取液几乎无吸收。2. 3标准曲线制备标准曲线见图7，强制过原点下，标准曲线方程为y = 0. 000099066x,r2 = 0. 9999，在5 ii g/ml 2500 ii g/ml范围内呈线性关系。2. 4回收率测定壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率见表I。壬苯醇醚-9在亚单位流感疫苗中的回收率见表2。2. 5精密度测定2. 5. I日内精密度日内精密度见表3。2. 5. 2日间精密度日间精密度见表4。2. 6检测限和定量限5 U g/ml标准品溶液的信噪比约为10，日内精密度和日间精密度均小于3%，本方法的检测限和定量限定为5 y g/ml。表I壬苯醇醚9在全病毒提取液中的回收率(n = 5)权利要求1.一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的检测方法，该方法包括以下步骤 (1)待检亚单位流感疫苗样品的处理， (2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚？9的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理，(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚？9的标准曲线，(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚？9的含量；其中步骤(1)和步骤(2)之间，以及步骤(2)和步骤(3)之间的顺序可以互换；其特征在于，HPLC检测采用的色谱柱是C4柱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田文莉，李小强，杨江山，张艳，
申请(专利权)人：天士力金纳生物技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：