一种用于细胞培养的微载体、其制备方法及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于细胞培养的载体，具体讲，涉及一种用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微载体、其制备方法及检测方法。本发明专利技术涉及一种用于细胞培养的微载体，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球，所述的微载体的电荷密度为0～3.5mmol/g-干球，湿真密度为1.01～1.10g/ml，粒径为50～800微米。其制备方法为将魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物。化学交联法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物，修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于细胞培养的载体，具体讲，涉及一种用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微载体、其制备方法及检测方法。
技术介绍
动物细胞是疫苗等蛋白质药物的主要生产方式。疫苗的生产过程中，动物细胞培养和表达决定了疫苗的产量和整个生产过程的效率。在动物细胞的大规模培养技术中，微载体培养法由于具有比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；采用均匀悬浮培养，无营养物或产物梯度；可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，劳动强度小；培养基利用率高，占地面积小；放大容易等优点，是目前公认的最有发展前途 的一种培养模式。由于对微载体技术的重视，国外已开发了数量颇多的微载体，部分已经商品化，主要的基质材料有交联葡聚糖、纤维素、蛋白质、高分子合成材料、无机玻璃材料以及液膜微载体等。交联葡聚糖是目前使用最广的一类微载体，大家熟悉的Cytodex系列(GE公司)就是这类微载体，其中，Cytodex I (即DEAE-交联葡聚糖)是当前用途最广的一种微载体。Cytodex3是将一层变性胶原(来自猪皮I型胶原)用化学偶联的方式连接到交联葡聚糖基质上。魔芋葡甘聚糖是由葡萄糖与甘露糖以￠-1,4-糖甘键连接而成的杂多糖，具有作为生化材料的良好性能，如亲水性、表面富含羟基易于修饰等。王佳兴等采用魔芋葡甘聚糖合成了凝胶型和大孔型的层析介质，授权号为ZL200610088917. 7，该专利公开了一种大孔型魔芋葡甘糖微球及其制备方法。该专利中制备的魔芋葡甘聚糖微球的目的为用于蛋白的分离和纯化。本专利技术对魔芋葡甘聚糖微球做了进一步的研究，发现通过采用化学交联的方法，魔芋葡甘聚糖微球可作为细胞培养的微载体，并取得了很好的效果。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种用于细胞培养的微载体。本专利技术的第二专利技术目的在于提供这种细胞培养的微载体的制备方法。本专利技术的第三专利技术目的在于提供这种细胞培养的微载体的质量检测方法。本专利技术的第四专利技术目的在于提供以魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球在用于细胞培养的微载体的应用。为了解决本专利技术的第一专利技术目的，采用的技术方案为本专利技术涉及一种用于细胞培养的微载体，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖微球为基质制备而成。该技术方案的第一优选技术方案为所述的微载体的电荷密度为0 3. 5mmol/g-干球,优选0. 5 3. Ommol/g-干球,更优选I 2. 5mmol/g-干球；湿真密度为I. 01 110g/ml，优选I. 01 I. 05g/ml ;粒径为50 800微米，优选100 300微米。该技术方案的第二优选技术方案为所述的微载体为凝胶型或大孔型，所述的大孔型微载体的孔径为0. 05 50微米，优选0. I 30微米，更优选0. 5 20微米。为了实现本专利技术的第二专利技术目的，本专利技术提供了该用于细胞培养的微载体的制备方法将魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物。该技术方案的第一优选技术方案为所述的魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接的方式包括以下几种方式(I)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合，再通过交联剂与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；(2)魔芋葡甘聚糖微球先与一端未经活化的交联剂反应结合后，然后活化交联剂上未经活化的官能团，活化后的官能团与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；(3)先将交联剂与修饰剂或覆层物连接，再通过交联剂上的官能团与魔芋葡甘聚 糖微球反应连接。该技术方案的第二优选技术方案为所述的化学交联的方法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物；所述交联剂上的双官能团或多官能团分别与微球、修饰剂或覆层物连接，或所述交联剂上的双官能团或多官能团经过活化后分别与微球、修饰剂或覆层物连接。该技术方案的第三优选技术方案为所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基。该技术方案的第四优选技术方案为所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘油醚基、氨基取代的烯烃；进一步优选环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4_ 丁二醇醚。该技术方案的第五优选技术方案为修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物；其中，所述胺及胺盐选自NH2R1' NHR1R2, NR1R2R3、R4-CO-NH-R5及其常用盐，其中R1、R2> R3、R4> R5分别选自取代或未取代的C1 15直链或支链的烷烃、取代或未取代的C卜15直链或支链烯烃，进一步优选取代或未取代的C2 12直链或支链的烷烃、取代或未取代的C2 12直链或支链烯烃；取代基选自氨基、羟基、卤素；所述的蛋白选自纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、软骨粘连蛋白、明胶；所述的多肽选自RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、YIGSR (酪氨酸_异亮氨酸_甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)、IKVAV (异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脱氢视黄醇)、多聚赖氨酸、多鸟氨酸；所述的多糖选自乳糖、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖、季胺化壳聚糖、海藻酸盐；所述的合成高分子化合物选自聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚醚酰亚胺(PEI)。该技术方案的第六优选技术方案为所述的胺及胺盐选自2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、己二胺、二乙胺、三甲基乙醇胺、N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、聚乙烯亚胺，正丙胺、n-庚胺、N-十二胺、乙醇胺。为实现本专利技术的第三专利技术目的，采用的技术方案为本专利技术还提供了一种所述的微载体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)含水量的测定方法采用TDL-40B型离心机以IOOOrpm离心5min，从干燥器中取两只已干燥至恒重的称量瓶，分别放入准确称量的待测样品3-5g，准确至lmg(O.OOlg);将介质摊平，称量瓶敞盖在100±5°C温度下烘干3h;称量瓶盖严后，取出置于干燥器中冷却至室温，在分析天平上称量；按式I计算含水量X ;X = Ml xl00% (I) Wl2 -M1式中X_介质样品的含水量， In1-空称量瓶的质量，g ；m2-烘干前称量瓶和介质样品的质量，g ；m3-烘干后称量瓶和介质样品的质量，g0(2)湿真密度的测定方法根据GB/T 8330-2008离子交换树脂湿真密度测定方法执行；(3)电荷密度的测定方法在量筒中准确量取二份各IOml已处理的微载体样品，将样品全部转入交换柱中，并测量此时的树脂床高度，通过50mL 0. 5mol/L氢氧化钠溶液，流速为0. 8 I. Oml/min，通毕后用蒸馏水进行洗淋，至流出液对酚酞不显色为止，测量此时的树脂床高度，用酸式滴定管准确量取25ml 0. lmol/L标准盐酸溶液加入到分液漏斗中，以0. 4 0. 5mL/min流速通过树脂床；通毕，用lmol/L氯化钠溶液充分淋洗漏斗及树脂床，所通过的酸液及淋洗液收集到锥形瓶中，加入2 3滴酚酞指示剂，用0. lmol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色并保持15s不褪色为终点，记录所耗碱液体积，介质样品的离子交换容量(E)按照式II进行计算；CV -C VE(mmol / g - T) = 11 22(II)ItllX (I—X)C1——盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞培养的微载体，其特征在于，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖微球为基质制备而成，所述的微载体的电荷密度为0～3.5mmol/g？干球，湿真密度为1.01～1.10g/ml，粒径为50～800微米。

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞培养的微载体，其特征在于，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖微球为基质制备而成，所述的微载体的电荷密度为O 3. 5mmol/g-干球,湿真密度为I. Ol I. 10g/ml，粒径为50 800微米。2.根据权利要求I所述的微载体，其特征在于，所述的微载体的电荷密度为0.5 3. Ommol/g-干球,优选I 3. Ommol/g-干球;湿真密度为I. 01 I. 05g/ml ;粒径为100 300微米。3.根据权利要求I所述的微载体，其特征在于，所述的微载体为凝胶型或大孔型，所述的大孔型微载体的孔径为0. 05 50微米，优选0. I 30微米，更优选0. 5 20微米。4.根据权利要求I所述的微载体，其特征在于，所述的魔芋葡甘聚糖微载体是由魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物制备而成。5.根据权利要求4所述的微载体，其特征在于，所述的魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接的方式包括以下几种方式 (1)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合，再通过交联剂与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接； (2)魔芋葡甘聚糖微球先与另一端未活化的交联剂反应结合后，然后活化交联剂上的官能团，活化后的官能团与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接； (3)先将交联剂与修饰剂或覆层物连接，再通过交联剂上的官能团与魔芋葡甘聚糖微球反应连接。6.根据权利要求4或5所述的微载体，其特征在于，所述的化学交联的方法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物；所述交联剂上的双官能团或多官能团分别与微球、修饰剂或覆层物连接，或所述交联剂上的双官能团或多官能团经过活化后分别与微球、修饰剂或覆层物连接。7.根据权利要求6所述的微载体，其特征在于，所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基。8.根据权利要求6所述的微载体，其特征在于，所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘油醚基、氨基取代的烯烃；进一步优选环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4- 丁二醇醚。9.根据权利要求4所述的微载体，其特征在于，修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物； 其中，所述胺及胺盐选自NH2RpNHR1RyNR1R2RpR4-CO-NH-R5及其常用盐，其中mR4、R5分别选自取代或未取代的C1 15直链或支链的烷烃、取代或未取代的C1 15直链或支链烯烃，进一步优选取代或未取代的C2 12直链或支链的烷烃、取代或未取代的C2 12直链或支链烯烃；取代基选自氨基、羟基、卤素； 所述的蛋白选自纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、软骨粘连蛋白、明胶； 所述的多肽选自RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)>YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：马光辉，周炜清，苏志国，王佳兴，孙李靖，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：