本发明专利技术公开了一种酿酒酵母工程菌及其在生产乙醇中的应用。本发明专利技术提供了酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)W32N55，其保藏号为CGMCC?NO.6090。还提供了酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)W32N55CGMCC?NO.6090在制备乙醇中的应用。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的工程菌W32N55是通过在出发菌株中导入木糖还原酶基因（XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)；同时提高木酮糖激酶(XK)的活性，得到酿酒酵母工程菌；进而将含有木糖还原酶基因（XYL1)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和木酮糖激酶(XK)基因的工程菌进行适应性驯化而得到的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种酿酒酵母工程菌及其在生产乙醇中的应用。
技术介绍
随着当前能源的日渐枯竭，石油价格的不断上涨以及温室效应所带来的全球变暖，迫使人们越来越重视对于可持续能源的开发和利用。当前，木质素资源成为全球较丰富的可再生资源，如果木质素资源能够充分利用，并实现清洁能源的转化，必将成为石油的最有利替代品。以燃料乙醇为主的生物燃料作为一种洁净和可再生的交通燃料，是目前最可行、·使用量最大的生物运输燃料之一，更是减少化石燃油消耗和温室气体排放最有效的方法之一。纤维素燃料乙醇技术不需要消耗粮食资源，也不占用耕地，原料来源广泛，价格低廉，是一项环境友好、可持续发展的技术。酿酒酵母在酒精发酵工业中具有上百年的应用历史，具有乙醇产量高，抗逆性强等特点，是当前酒精生产行业必不可少的生产菌株。所有植物来源的木质纤维素资源都包含有丰富的纤维素，半纤维素，木质素等。通过预处理及酶解后，得到的大多是葡萄糖，同时还含有一定量的五碳糖(主要为木糖)。要想利用木质纤维素资源发酵生产酒精行业，就要求菌株必须同时可利用葡萄糖和木糖来转化生成酒精。天然的酿酒酵母不能利用木糖生长发酵，但却可以将木酮糖转化成乙醇，具备从木酮糖到乙醇的代谢途径。与天然可以利用木糖酵母相比较，酿酒酵母缺乏了从木糖到木酮糖的代谢途径。目前国内外许多实验室已经从事了关于构建可利用木糖的酿酒酵母工程菌株的研究，但大多数的酿酒酵母工程菌株只能在好氧及限氧条件下进行木糖发酵，而且由于副产物木糖醇的生成量较大，其木糖对于乙醇的糖醇转化率相对较低，不能够有效的代谢木糖(Kuype等，FMES Yeast Research,2004 ；Mervi H. T.等，Metabolic Engineering, 2001)。纤维素水解液是理想的乙醇生产原料，由于在其水解成糖液的过程中需要经过酸碱的处理，因此含有高浓度的乙酸，糠醛等抑制物，限制了菌株对于乙醇的发酵。当前国际上对于利用木糖工程菌株发酵纤维素水解液的报道很少，主要是由于菌株本身对于水解液抑制物的耐受性较差。普度大学Nancy Ho.团队构建的一株酿酒酵母工程菌株是目前可利用纤维素水解液发酵生产乙醇的菌株，该菌株在水解液中能共利用葡萄糖及木糖发酵乙醇，且乙醇得率相对较高，但是该菌株在发酵时需要较高的接种量通常水解液发酵接种量为IOg dry wt/L (Ming W. Lau等，PNAS，2009)。这些因素都极大的限制了纤维素乙醇产业化的进程。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一株酿酒酵母。本专利技术提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55,其保藏号为CGMCCNO. 6090。上述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55CGMCC NO. 6090在制备乙醇中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种生产乙醇的方法。本专利技术提供的方法，是液体发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W32N55CGMCC NO. 6090，收集发酵产物，即得到乙 醇。上述方法中，所述液体发酵采用的培养基为发酵培养基或玉米秸杆纤维素酶水解液；所述发酵培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、木糖和水混合，得到发酵培养基；所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为l_20g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的浓度均为5-100g/L ；所述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖总含量为50_200g/L，所述玉米秸杆水解液中的葡萄糖和木糖的质量比为1:1-10: I。上述玉米秸杆纤维素酶水解液按照如下方法的制备将玉米秸杆先采用气爆的方法得到气爆产物，其中气爆条件为2. 3Mpa，3min，50%含水量；再将气爆产物采用纤维素酶进行酶解96h(纤维素酶购自山东隆大生物工程有限公司，100000U/ml)，得到玉米秸杆纤维素酶水解液。上述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖的比例(质量比)为3:1，葡萄糖和木糖的总糖含量约为200g/L。上述方法中，所述液体发酵包括如下步骤I)先将所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiac) W32N55CGMCC NO. 6090接种于种子培养基中培养，得到种子培养液；再将所述种子培养液离心收集菌体；2)将所述菌体按照3g干重/L的量接种到所述发酵培养基或所述玉米秸杆纤维素酶水解液中发酵，收集发酵产物。上述方法中，步骤I)中，所述培养的条件为30°C、250rpm培养18h小时；离心为4500rpm,离心7min,离心半径3cm ；步骤2)中，所述发酵的时间为30h_72h ;所述发酵的温度为30°C _40°C，所述发酵为厌氧发酵。上述方法中，步骤I)中，所述种子培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和水混合，得到种子培养基；所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述种子培养基中的浓度为l_20g/L，所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度均为 l-20g/L。上述方法中，在所述步骤2)后还包括如下步骤将所述发酵产物离心收集上清液得到乙醇。上述离心的转速为13000rpm,离心(离心半径为3cm)时间为2min。因此上述菌株W32N55，已于2012年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJias :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 6090，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的工程菌W32N55是通过在出发菌株中导入木糖还原酶基因(XYLl)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)，并使之表达出活性；同时提高木酮糖激酶(XK)的活性，得到酿酒酵母工程菌；进而将含有木糖还原酶基因(XYLl)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2)和木酮糖激酶(XK)基因的工程菌进行适应性驯化而得到的。本专利技术所构建的酿酒酵母工程菌W32N55在厌氧条件下，发酵57h可完全消耗45g/L木糖，产生16g/L乙醇；采用发酵-膜分离耦合工艺，在利用含总糖为200g/L的玉米秸杆水解液发酵时，发酵72h总糖利用率可达88%，产乙醇74g/L，总糖糖醇转化率在0. 42g/g左右。附图说明图I为质粒pXYLl_2u (LEU2) -XYL2-XK的结构示意2为工程菌株W32N55木糖发酵示意3为工程菌株W32N55纤维素水解液发酵示意图具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、重组菌株W32N55的获得一、重组工程菌的构建I、质粒的构建I)质粒 pXYLl-2 U (LEU2)质粒pXYLl_2li(LEU2)为将xyll 基因(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/X59465. I)插入载体 plasmid-2 u (LEU2)(载体 plasmid-2 u (LEU2)为将 pYES2 载体 ura筛选标记换成Ieu筛选本文档来自技高网...
【技术保护点】
酿酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)W32N55，其保藏号为CGMCC？NO.6090。
【技术特征摘要】
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55,其保藏号为 CGMCC NO. 6090。2.权利要求I 所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W32N55 CGMCC NO. 6090在制备乙醇中的应用。3.一种生产乙醇的方法，是液体发酵权利要求I所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W32N55 CGMCC NO. 6090，收集发酵产物，即得到乙醇。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述液体发酵采用的培养基为发酵培养基或玉米秸杆纤维素酶水解液； 所述发酵培养基按照如下方法制备将酵母粉、蛋白胨、木糖和水混合，得到发酵培养基；所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为l-10g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中 的浓度为l_20g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的浓度均为5-.100g/L ； 所述玉米秸杆纤维素酶水解液中的葡萄糖和木糖总含量为50-200g/L，所述玉米秸杆水解液中的葡萄糖和木糖的质量比为1:1-10:1。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于 所述液体...
【专利技术属性】
技术研发人员：张延平，张博，张海峰，孙红兵，李寅，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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