检测耐多药结核分枝杆菌的方法及其相关引物和液相芯片技术

本发明专利技术提供了检测耐多药结核分枝杆菌的方法及和芯片。本发明专利技术的方法和芯片涉及对katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变型的检测。本发明专利技术还提供了用于检测上述突变型的引物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物领域，具体而言涉及耐多药结核分枝杆菌的检测。
技术介绍
耐多药结核病在全球发病率高、死亡率高，尤其发生在亚洲，特别是中国和印度。现在对结核病进行治疗一般选择药物利福平(RIF)和异烟肼(INH)，临床上只要同时对该两种药物产生耐药即被诊断为耐多药结核病(MDR, Multi-drug-resistanttuberculosis)。耐多药结核病治疗十分困难，几乎成为不治之症。所以，医学界把严重的耐多药结核病等同于癌症。导致耐多药结合病的结合分支杆菌称为耐多药结核分枝杆菌。在现阶段，广泛采 用传统的药物敏感性试验来检测耐多药结核分枝杆菌，该方法是基于表现型耐药，在含多种相关药物的固体培养基上接种对数生长期的结核杆菌，当结核菌能在抑制结核菌生长的最低药物浓度(MIC)下生长时被界定为耐多药结核分枝杆菌，该方法培养条件要求高、工作量大、检测周期长、检出率低，不能满足临床要求。近年来，若干基于PCR的分子诊断技术逐渐应用于耐多药结核分枝杆菌检测中，这类方法是通过检查的基因突变来确定耐多药结核分枝杆菌。大多数这类方法以尼龙膜为载体进行核酸杂交，该方法载体前处理复杂，时间较长，灵敏度不高，结果需人为判断，且不易储存。等位基因特异性PCR，根据Taq DNA聚合酶不能修复引物在3’末端的碱基错配这一原理，当引物的3’末端核苷酸与等位基因序列完全互补时，模板被扩增，该技术无法判断检测位点突变成何种碱基，且结果由核酸电泳判断，灵敏度低、容易产生假阳性。PCR-线性探针杂交技术(PCR-LiPA)，其原理是核酸的反向杂交法，根据杂交结果判定突变存在与否。基于这一原理，目前市场上已经有用于检测耐药基因突变的商业化诊断试剂盒，主要包括 Genotype MTBDR (Hain Lifescience, GmbH, Nehren, Germany)和INNO-LiPA Rif. TB (Innogenetics, Ghent, Belgium)两种。这类试剂盒基本能有效地检测出耐多药结核分枝杆菌，但是只能对rpoB基因进行粗筛，其数据不易储存，结果受主观因素影响较大，并且实验费用昂贵，需要精密的实验仪器，在低收入、高发病率国家难以推广。而且，由于对耐多药结核分枝杆菌突变位点选择的原因，这些方法检测结果中假阳性和/或假阴性较高。另外上市的还有一种Xpert MTB的检测方法采用半巢式实时定量PCR方法扩增rpoB基因一段特殊的MTB序列，该序列作为一个探针和利福平耐药基因决定区突变的分子信标结合从而得到检测结果。该方法只能检测rpoB基因的突变，且由于实验条件的变化包括实验仪器及处理条件如温度时间等有变化而使实验结果不稳定，同时该方法采用了很多先进的硬件设备，这无疑大大的增加了检测成本，资金的大量投入使得一些发展中国家难以承受，另外该仪器也不能用于其他方面检测。传统固相芯片，诊断结核杆菌耐药的DNA芯片是固定在玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定DNA探针。为使其固定在载体上，对探针和载体都需要活化。将样品进行PCR扩增，进行荧光标记，再与DNA芯片杂交。可以通过专用激光芯片扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因探针位点的杂交信号的强弱，从而确定结核分支杆菌目标DNA是否发生突变。由于该检测环境为固相，不利于PCR产物与探针的结合，且检测载体为玻片，体积远远大于微米级别，当样本数量多的时候，则不能有效进行高通量的检测。另外，虽然该方法检测时间短，但是对仪器及技术人员要求高，重复性差，不能有效进行高通量检测。因此，本领域中需要一种准确度高、敏感性高、特异性强、步骤简单、快速并且高通量的检测耐多药结核分枝杆菌的方法。
技术实现思路
本专利技术人经过多次尝试发现，通过检测katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变位点可以有效检测耐多药结核分 枝杆菌。为了实现本专利技术的方法，本专利技术人经过多次实验，提供了用于检测katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变位点的特异性引物序列，包括针对katG315野生型位点的SEQ ID NO. 12，针对katG315突变型I位点的SEQ ID NO. 13，针对katG315突变型II位点的SEQ ID NO. 14 ;针对rpoB526野生型位点的SEQ ID NO. 15，针对rpoB526突变型I位点的SEQ ID NO. 16，针对rpoB526突变型II位点的SEQ ID NO. 17 ;针对rpoB531野生型位点的SEQ ID NO. 18，针对rpoB531突变型I位点的SEQ ID NO. 19，针对rpoB531突变型II位点的SEQ ID NO. 20 ;针对inhA-15野生型的SEQ ID NO. 21，针对inhA-15突变型的SEQ ID NO. 22。这些该引物序列特异性强，能够准确地区分出各种基因型，并且多位点同时检测不存在交叉干扰。另外，本专利技术人经过多次实验，还提供了扩增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位点的目标序列的扩增引物，所述扩增引物包括针对katG基因315密码子位点的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35，针对rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子位点的 SEQ ID NO. 36 和 SEQ ID NO. 37，针对 inhA 基因启动子-15 位点的 SEQ ID NO. 38 和 SEQID NO. 39。因此，本专利技术的一个目的是提供一种使用上述特异性引物序列和扩增引物检测耐多药结核分枝杆菌的方法。在一个方面中，本专利技术提供了一种使用上述特异性引物序列和扩增引物检测耐多药结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤I)使用扩增引物扩增一个样品的DNA从而得到扩增产物，并纯化所述扩增产物，所述扩增引物的序列为SEQ ID NO. 34-SEQ ID NO. 39 ；2)用特异性引物对进行上述延伸反应产物进行延伸，所述特异性引物为SEQ IDNO. 12-SEQ ID NO. 22，如果SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 18 不延伸，而SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ IDNO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20中至少之一延伸，那么所述样品中存在耐多药结核分枝杆菌。本专利技术的另一个目的是提供一种检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片，该液相芯片可用于检测katG基因315密码子、rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子、inhA基因启动子-15位的野生基因型和已知7种常见的突变型。 在另一方面，本专利技术提供了一种检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片，包括I)带标签序列的特异性引物，每个带标签序列的特异性引物由5’端的标签序列和3’端的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自SEQ ID NO.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片,包括 1)带标签序列的特异性引物，每个带标签序列的特异性引物由5’端的标签序列和3’端的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22，不同引物序列连接不同标签序列，其中所述标签序列长度优选为10至50个核苷酸； 2)分别包被有标签互补序列的微球，所述标签互补序列是I)中的标签序列的互补序列。2.权利要求I的耐多药结核分枝杆菌检测液相芯片，还包括 3)扩增引物序列，所述扩增引物序列选自SEQID NO. 34-SEQ IDNO. 39。3.权利要求I或2的耐多药结核分枝杆菌检测液相芯片，所述标签序列选自SEQIDNO. I-SEQ ID NO. 11，所述标签互补序列选自 SEQID NO. 23-SEQ ID NO. 33。4.权利要求3的耐多药结核分枝杆菌检测液相芯片，所述带标签序列的特异性引物分别选自由 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 12 组成的序列，由 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 13组成的序列，由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14组成的序列；由序列SEQ ID NO. 4和SEQ IDNO. 15组成的序列，由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 16组成的序列，由SEQ IDNO. 6和SEQ IDNO. 17组成的序列；由序列SEQ ID NO. 7和序列SEQID NO. 18组成的序列，由序列SEQ IDNO. 8和序列SEQ ID NO. 19组成的序列，由序列SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20组成的序列；由 SEQID NO. 10 和 SEQ ID NO. 21 组成的序列，由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ IDNO. 22 组成的序列。5.权利要求1-4任一项的耐多药结核分枝杆菌检测液相芯片,所述标签互补序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。6.权利要求5的结核分枝杆菌耐药性检测液相芯片，其中所述间隔臂序列为5-10个T。7.一种耐多药结核分枝杆菌检测液相芯片，包括 1)带标签序列的特异性引物，其选自由 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 12 组成的序列，由 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 13 组成的序列，由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14组成的序列；由 SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 15 组成的序列，由 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 16 组成的序列，由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 17组成的序列；由 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 18 组成的序列，由 SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 19 组成的序列，由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20组成的序列；由 SEQ ID NO. 10 和...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜春来，孔维，韩明明，
申请(专利权)人：长春百克生物科技股份公司，吉林大学，
类型：发明
国别省市：