本发明专利技术公开一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，依次按如下方法制备：将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿，与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物；在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于的醋酸溶液中，制得叶酸壳聚糖醋酸溶液，将川芎嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌下，滴加浓度为0.6mg/ml的多聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌30min，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的混悬液；将所制备的混悬液离心后收集沉淀，冻干。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种MDR逆转剂，尤其是一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖)I丨芎嗪纳米粒制剂。
技术介绍
多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象可严重妨碍肿瘤的化疗效果。MDR由多种机制引发，最具代表性的是由于耐药细胞表面P-gp、多药耐药相关蛋白等跨膜蛋白的高表达所形成的外排泵，使细胞内化疗药物外排所造成的。MDR的产生不仅保护了肿瘤细胞，所排出的化疗药还增加了对正常组织的损伤。研究表明，具有钙离子通道拮抗作用的部分天然药物成分如川芎嗪、丹参酮IIA、苦参碱、去甲斑蝥素等具有MDR逆转作用，尤其川芎嗪逆转MDR的作用非常突出。尽管川芎嗪能显著增加化疗药物的敏感性，但目前却难以广泛应用于临床，主要原因是缺少良好的给药载体，致使川芎嗪在体内广泛分布，增加了对正常人体细胞的损伤，不良反应发生率较高。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂。本专利技术的技术解决方案是一种叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于依次按如下方法制备 a.将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿； b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物； c.在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于浓度为1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的叶酸壳聚糖醋酸溶液15ml,将18mg川弯嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力搅拌下，滴加5ml浓度为0. 6 mg/ml的多聚磷酸钠水溶液,滴加完毕后，继续磁力搅拌30min,即得叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒的混悬液； d.将所制备的混悬液4°C下32900 rpm/min离心30min,离心后弃上清,收集沉淀，分散在去离子水中，加冻干保护剂，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的粉末。所述a步骤是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸液，过滤除去不溶性杂质，60°C磁力搅拌下加入过量的双氧水至2小时，用NaOH调PH值至产生白色沉淀，过滤收集白色沉淀，用去离子水洗至中性，无水乙醇浸泡2h，抽滤沉淀并在常温下干燥，即制得分子量为5万道尔顿的壳聚糖。所述b步骤是称取150mg叶酸，用DMSO溶解，再加入150mg脱水缩合剂，25°C避光搅拌I小时，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；称取IOOmg分子量为5万的壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液(PH5)中，并在磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反应过夜，然后用NaOH调pH至橘红色沉淀析出，上述叶酸与壳聚糖用量的摩尔比为170 1 ;将上一步的混合液及橘红色沉淀一同装入透析袋中，先于pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3天，然后再于去离子水溶液中透析3天；将透析袋内的混合液全部转移至西林瓶中，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸壳聚糖偶联物。壳聚糖(CMC)具有生物可降解性、生物相容性、低毒性、良好的粘附性和成膜能力等特点；叶酸受体(FA)是一种糖蛋白受体，在正常组织中的表达高度保守，而在许多肿瘤细胞如Hela、MCF-7等呈过渡表达。本专利技术是将叶酸偶联壳聚糖并以此作为载体包载川芎嗪，制成MDR逆转剂，具有主动靶向性强等特点，可对靶组织(肿瘤细胞)高浓度聚集，减小对正常组织的毒副作用，延长药物作用时间，减少给药次数。附图说明图I :降解时间与壳聚糖分子量(n=3)的关系不意图。图2 :高、低分子量壳聚糖红外扫描图谱。 图3 :叶酸壳聚糖、壳聚糖、叶酸红外扫描图谱。图4 :叶酸壳聚糖1H-核磁共振扫描图谱。图5 :叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒粒径大小及分布示意图。图6 :叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒透射电镜图。图7 :川芎嗪溶液与叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒体外释放累积曲线。图8 :激光共聚焦显微镜观察细胞对样品中川芎嗪的摄取图。图9 :本专利技术实施例纳米粒的体外靶向作用示意图。具体实施例方式本专利技术实施例依次按a、b、C、d步骤制备 a.将壳聚糖分子量降解到5万道尔顿，具体做法是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸液，过滤除去不溶性杂质，60°C磁力搅拌下加入过量的双氧水至2小时，用NaOH调pH值至10左右，得到白色沉淀，过滤收集白色沉淀，用去离子水洗至中性，无水乙醇浸泡2h，抽滤沉淀并在常温下干燥，即制得分子量为5万道尔顿的壳聚糖。采用粘度法测定各降解时间壳聚糖的粘均分子量(#,)，以0. I mo I L^1CH3CO2Na和0. 2 mo I L-1CH3COOH为溶剂，将不同降解时间的壳聚糖配制成一定浓度的溶液，在30°C恒温水浴条件下，用乌氏粘度计测定各样品的分子量。壳聚糖的分子量与降解时间的相关性见图1，当降解2h时，壳聚糖的分子量降解到5万。分别取干燥的壳聚糖及降解的壳聚糖样品适量，与KBr粉末混研压片，然后在红外光谱仪中进行分析，分辨率为2cm—1，红外图谱见图2，a，b分别是壳聚糖与降解壳聚糖的红外光谱图，从图2中可以看出a，b两个红外光谱图基本一样，说明壳聚糖经双氧水降解后，结构基本不发生变化，仅分子量降低。b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物，具体做法是称取150mg叶酸，用IOml的DMSO溶解，再加入150mg脱水缩合剂(I-乙基-3- (3—二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)，25°C避光搅拌I小时，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；称取IOOmg分子量为5万的壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5)中，并在磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反应过夜，然后用NaOH调pH至10左右，有橘红色沉淀析出；将上一步的混合液及橘红色沉淀一同装入透析袋中，先于PH 7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3天，然后再于去离子水溶液中透析3天；将透析袋内的混合液全部转移至西林瓶中，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸壳聚糖偶联物。化学反应方程式如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于依次按如下方法制备 a.将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿； b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物； c.在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于浓度为1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的叶酸壳聚糖醋酸溶液15ml,将18mg的川弯嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力搅拌下，滴加5ml浓度为0. 6 mg/ml的多聚磷酸钠水溶液,滴加完毕后，继续磁力搅拌30min,即得叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒的混悬液； d.将所制备的混悬液4°C下32900rpm/min离心30min,离心后弃上清,收集沉淀，分散在去离子水中，加冻干保护剂，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的粉末。2.根据权利要求I所述的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于所述a步骤是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：范青，程荔春，马辉，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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