本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，具体为一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法。本发明专利技术采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养获得的丹参毛状根种株接种到GamborgB5液体培养基中，黑暗培养箱中用振荡培养若干天，然后转移到含有脱落酸的GamborgB5液体培养基中培养1-9天。本发明专利技术处理后得到的丹参毛状根中包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮等丹参酮类化合物的含量提高了2～6倍。本发明专利技术为利用丹参毛状根快速高效生产丹参酮类活性成分提供了有效途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及。
技术介绍
参{Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国一种传统中草药，因根赤色得名，始载于《神农本草经》，列为上品，能活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈，现代临床上常用于心血管疾病的治疗，具有极高的药用价值。丹参的主要药用活性成分为水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物，其中丹酚酸B O 3. 0%)和丹参酮IIA ( ^ O. 2%)是《中国药典》规定的指标成分。丹参的这二类化合物都具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗HIV、抗过敏、抗炎、以及扩张冠状动脉等生物活性活性。现代医学研究表明不同结构丹参酮类成分生物活性存在差异丹参酮I能提高学习和记忆能力，丹参酮IIA则具有抗增生的活性，并能缓解骨吸收疾病的症状；二氢丹参酮I和隐丹参酮这两种具有二氢呋喃环的丹参酮具有抗菌、抗过敏效果。此外，作为二萜醌类色素的丹参酮类成分在植物天然色素开发领域受到了额外的关注。应对目前丹参野生资源日益匮乏，栽培品种的药材质量差别大、品质严重退化、生长周期长等种种困境，生物工程技术或植物组织培养技术为丹参次生代谢物的获取提供了一种优良的替代生产体系，其中利用发根农杆菌iAgrobacterium rhizogenes)感染丹参获得转化毛状根的技术使工业化生产丹参药用有效活性成分成为可能。毛状根培养系统具有激素自主、遗传稳定、生长快速等优势，较之植物细胞更适合工业规模的生产。通常毛状根能够稳定合成母体植物中绝大多数次生代谢物，甚至还有可能形成一些新的化合物。但转化过程中Ri基因插入宿主基因组中位置的随机性和拷贝数的不确定性导致不同毛状根株系间的产物性质及生长速度等生理特征存在差异。在研究初期，丹参毛状根的丹参酮类含量仅为干重的O. 036%-0. 068%，远小于生药中O. 15%丹参酮的含量。采用生物或非生物诱导子诱导提高丹参毛状根活性成分的产量是行之有效的方法，迄今为此，已报道利用酵母提取物、茉莉酸甲脂、山梨酸、银离子(Ag+)等作为诱导子诱导提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，但未见采用脱落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)为诱导子诱导提高丹参酮类成分产量的研究。本专利技术将脱落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)加入到丹参毛状根悬浮培养体系中诱导提高丹参酮类成分，并对其最适浓度与最佳处理时间获进行了优化，为提高丹参毛状根丹参酮产量提供了新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种工艺简单、成本低廉的显著提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法。本专利技术的另一个目的在于提供由本专利技术利用丹参毛状根生产的丹参酮类活性成分，并提供这些成分在制备丹参总酮提取物、丹参酮IIa和隐丹参酮单体成份，以及在丹参酮类药物制剂方面的应用。本专利技术的再一个目的在于提供利用丹参毛状根生产的丹参酮类作为天然色素，在食品、药品以及化妆品领域的应用。本专利技术提供的提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，是采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为将在6，7-V固体培养基上培养3-4周获得的丹参毛状根种株接种到Gamborg B5液体培养基中，20_30°C黑暗培养箱中用100-300 rpm水平振荡培养15-30天，然后转移到含有脱落酸的Gamborg B5液体培养基中培养1-9天；所述脱落酸的浓度为1-100 μ mol/L。本专利技术中，所用丹参毛状根是利用发根农杆菌C58C1诱导丹参无菌苗外植体产生丹参毛状根株系5M)31103。 本专利技术中，所述脱落酸的处理浓度优选为1-25 μ mol/L。本专利技术中，所述丹参酮类成分包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I和隐丹参酮。本专利技术采用脱落酸处理丹参毛状根，显著诱导和提高了丹参酮类成分的含量。实验证明，采用浓度为1-100 μ mol/L的脱落酸处理丹参毛状根1-9天丹参毛状根中总丹参酮类成分的含量可提高2-6倍。经本方法优化后的最佳脱落酸效应浓度为1-25 μ mol/L(约O. 26-7. 5 mg/L)。本专利技术成本低廉，操作简便，为利用丹参毛状根培养体系生产丹参药用活性成分提供了一个稳定、高效的途径。本专利技术的具体操作步骤如下 (I)丹参毛状根的诱导应用发根农杆菌C58C1侵染丹参无菌外植体形成毛状根。待毛状根长到2厘米左右切下，除菌后在6，7-V固体培养基上培养，经筛选获得丹参毛状根5^031103。(2)丹参毛状根的固体培养将毛状根兔031103在6，7_V固体培养基上，22°C黑暗静置培养，3-4周后继代一次。(3)丹参毛状根的液体悬浮培养毛状根兔031103在6，7_V固体培养基上培养了 3-4周后，挑取鲜嫩粗壮的毛状根转入稀释一倍的Gamborg B5液体培养基，22°C，黑暗，120rpm水平振荡培养3周。(4)脱落酸诱导处理将液体悬浮培养3周后的丹参毛状根转入含有一定浓度脱落酸的新鲜稀释一倍的Gamborg B5液体培养基，诱导提高毛状根中丹参酮类成分的含量。其中，脱落酸的处理浓度为1-100 μ mol/L,优选为1-25 μ mol/L。脱落酸处理时间为1-9天，优选为7-9天。本专利技术所述丹参毛状根,是由唇形科鼠尾草属植物丹参{Salvia miltiorrhizaBge.)无菌幼根或幼苗,经发根农杆菌iAgrobacterium rhizogenes, C58C1株系)诱导形成的毛状根。本专利技术中，所述6，7-V固体培养基组成为(mg/L) : (I)大量元素((NH4)2SO4 100;KNO3 800; Na2HPO4 · 12H20 20; MgSO4 · 7H20 250; CaCl2 · 2H20 200; NaH2PO4 150; KCl200) ； (2)微量元素(NaMoO4 · 2H20 O. 25; CoCl2 · 6H20 O. 25; KI O. 05; MnSO4 · 4H20 4. 0;ZnSO4 · 7H20 I. 5; H3BO3 5. 0) ； (3) Fe 盐((EDTA)2FeNa · 3H20 21. I) ； (4)有机成分(VB10.5; VB6 0.5;烟酸1.5;肌醇100)。所述Gamborg B5液体培养基组成为(mg/L) :(1)大量元素((NH4)2SO4 134; KNO3 2500; NaH2PO4 · H2O 150; MgSO4 · 7H20 250; CaCl2 · 2H20150) ； (2)微量元素(NaMoO4 ·2Η20 O. 25; CoCl2 · 6Η20 O. 025; KI O. 75; MnSO4 · 4Η20 10;ZnSO4 ·7Η20 2. O; H3BO3 3. O) ； (3) Fe盐(CuSO4 ·5Η20 O. 025; Na2 .EDTA 37. 3; FeSO4 ·7Η2027.8) ；(4)有机成分(VB1IO; VB6 1.0;烟酸 1.0;肌醇 100)。上述培养基用浓度为I mol/L的NaOH和HCl调节pH值至5. 6-5. 8后，加入3%蔗糖(固体培养基中还需加入7. 5 g/L琼脂粉)，121°C高压灭菌备用。本专利技术还提供一种从丹参毛状根中提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高丹參毛状根中丹參酮类活性成分产量的方法，其特征在于采用脱落酸处理悬浮培养的丹參毛状根提高丹參酮类成分产量，具体步骤为将在6，7-V固体培养基上培养3-4周获得的丹參毛状根种株接种到Gamborg B5液体培养基中，20_30°C黑暗培养箱中用100-300 rpm水平振荡培养15-30天，然后转移到含有脱落酸的稀释一倍的GamborgB5液体培养基中培养1-9天；所述脱落酸的浓度为1-100 μ mol/L。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所用丹參毛状根是...
【专利技术属性】
技术研发人员：周铜水，杨翼信，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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