本发明专利技术公开了一种红豆杉成熟胚乳诱导单倍体胚乳愈伤组织的方法。包括：（1）种子外种皮剥离：利用机械破壳，手工剥离外种皮；（2）外植体消毒：依次经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用；（3）种子预处理：用无菌水密封常温浸种1-5天；（4）胚乳组织的分离；（5）胚乳愈伤组织的离体诱导：将种子胚乳接种到愈伤组织诱导培养基上，30天后可以获得97.92%的诱导率。本发明专利技术能简便、快速获得红豆杉成熟胚乳愈伤组织，为简化遗传分析、染色体操作、作为转基因材料以及基因组学研究材料打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养领域，具体涉及。
技术介绍
紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世纪六七十年代从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus L.)植物树皮中分离出来的一种天然的四环二萜类生物碱，其在治疗宫颈癌、乳腺癌、小细胞肺癌、黑素瘤和结肠癌等方面有显著的疗效。紫杉醇首先在太平洋短叶红豆杉的树皮和形成层中提取出来。按照目前的纯化技术，生产Ikg的紫杉醇大约需要10吨红豆杉树皮。这大约需要从2000到4000棵60-70年生的红豆杉中才能获得。据相关资料介绍，每年全球大约需要消耗250kg紫杉醇纯品。这需要从250万千克树皮或者75万棵 红豆杉中提取才能满足这一市场的需要。随着对紫杉醇需求量的日益递增，目前仅仅从天然的红豆杉林树体中提取分离紫杉醇的产量已经不能满足医药市场需要，加之大肆的开采使红豆杉自然资源日趋枯竭、红豆杉资源自然更新能力差、生长缓慢、濒危灭绝，各国政府已明文规定禁止砍伐野生红豆杉资源。自从1921年意大利植物学家Blakesly在自然界中发现曼陀罗的单倍体植株以来，单倍体材料因其较高的利用价值，例如控制杂种后代分离、提高选择效率、简化遗传分析、染色体操作、作为转基因材料以及基因组学研究材料而受到重视，相续在植物已有报道。但目前报道的单倍体材料的获得除自发突变产生的单倍体外，其主要途径是通过花粉培养、胚珠离体培养和小孢子培养获得，而红豆杉属裸子植物，因材料自身的特殊性其胚乳为单倍体组织(张宗勤等，红豆杉，西北农林科技大学出版社，2010)，故通过胚乳的离体培养便可以获得单倍体愈伤组织。红豆杉种子中含有较多抑制种子萌发的物质，如南方红豆杉种子中含有正庚酸、壬酸、乙酸等发芽抑制物质，其种皮、内种皮和胚乳的浸泡液对白菜种子发芽率和幼苗的生长、根生长均有抑制作用，并且与浸提液浓度呈正比(张艳杰等，南方红豆杉种子种发芽抑制物的研究，南京林业大学学报(自然科学版)，2007，4(31) :51-58)。根据目前的研究报道还没有成功报道通过红豆杉胚乳愈伤组织诱导获得单倍体愈伤组织的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的是通过以下方式实现的。—种红豆杉成熟胚乳诱导单倍体胚乳愈伤组织的方法，包括以下步骤( I)种子种胚的剥离将南方红豆杉种子从外种皮中剥离出来；(2)外植体消毒取步骤(I)得到的种子，用70%的酒精和O. 1%的氯化汞表面消毒，再用无菌水清洗；(3)种子的预处理将步骤(2)消毒的种子用无菌水浸泡1-5天；(4)胚乳组织的分离在无菌条件下剥取种子的胚乳组织；(5)胚乳愈伤组织的离体诱导将剥离的胚乳组织接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；所述的诱导培养基为B5培养基+Piculoram (毒莠定)2-5mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA33mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，培养条件为24± 1°C条件下暗培养。所述步骤(I)中的红豆杉种子为当年生或者4°C保存1-2年的南方红豆杉种子。所述步骤(2)清洗消毒过程具体如下先将去除外种皮的种子放入无菌的容器中，在超净工作台内依次经70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用。 所述步骤(3)种子预处理具体过程如下将去掉外种皮的种子经过步骤(2)的表面消毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下无菌密封浸泡1-5天。步骤(5)得到胚乳愈伤组织后可以进行继代培养，继代培养的培养基为=B5培养基 +Piculoram 2-3mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA3lmg/L+ 鹿糖 20g/L+ 琼脂 7g/L ;培养条件为24±1°C条件下暗培养。该专利技术具有以下优点(1)外植体污染率极低；(2)种子预处理简单，用静水处理可以大量节约水资源；(3)通过一步培养可以获得红豆杉单倍体愈伤组织；诱导率达到97. 92% ； (4)为简化遗传分析、染色体操作、作为转基因材料以及基因组学研究材料打下基础，(4)为获得红豆杉单倍体愈伤组织进行红豆杉全基因组测序打下基础。附图说明图I是采用本专利技术方法利用红豆杉成熟胚乳诱导单倍体胚乳愈伤组织的过程，其中A.红豆杉种子及去种皮的种子；B.胚乳组织在愈伤组织诱导培养基上培养12d ；C.胚乳组织在愈伤组织诱导培养基上培养20d ；D.胚乳组织在愈伤组织诱导培养基上培养30d ；E.胚乳愈伤组织在继代培养基上培养IOd ；图2是本专利技术中获得的红豆杉胚乳单倍体愈伤组织的流式细胞仪细胞检测结果，其中F.种胚来源的二倍体植株倍性检测结果；G.南方红豆杉单倍体愈伤组织倍性检测结果。具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本专利技术，而不会限制本专利技术。实施例I(I)种子种胚的剥离收集当年生的南方红豆杉种子，使用机械结合手工方法破壳，将种子从外种皮中剥离出来；(2)外植体消毒先将去除外种皮的种子放入无菌的容器中，在超净工作台内经70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用，清洗时每次浸种5分钟左右。(3)种子的预处理将去掉外种皮的种子经过步骤(2)的表面消毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下密封浸泡1-3天。(4)胚乳组织的分离在无菌条件下剥取种子的胚乳组织，其他部分弃除；(5)胚乳愈伤组织的诱导将胚乳组织接种到诱导培养基上24土1°C条件下暗培养，经过30天的培养可以获得红豆杉 胚乳愈伤组织，诱导率达到97. 92% ;诱导培养基是B5培养基 +Piculoram3mg/L+6-BA O. 5mg/L+GA33mg/L+ 鹿糖 20g/L+ 琼脂 7g/L ;当其他条件不变，而诱导培养基中Piculoram的含量在2_5mg/L范围内变化时，愈伤组织均生长良好，诱导率均能达到97%以上。(6)胚乳愈伤组织的继代培养将胚乳愈伤组织接种到继代培养基上24土1°C条件下暗培养，继代培养基是B5培养基+Piculoram 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+GA3lmg/L+鹿糖20g/L+琼脂7g/L ;红豆杉胚乳愈伤组织能正常增殖培养；当其他条件不变，而继代培养基中Piculoram的含量在2_3mg/L范围内变化时，红豆杉胚乳愈伤组织也能正常增殖培养。结果请见附图。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种红豆杉成熟胚乳诱导单倍体胚乳愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)种子种胚的剥离将南方红豆杉(Taxaleschinensis var. mairei)种子从外种皮中剥离出来； (2)外植体消毒取步骤(I)得到的种子，用70%的酒精和O.1%的氯化汞表面消毒，再用无菌水清洗； (3)种子的预处理将步骤(2)消毒的种子用无菌水浸泡1-5天； (4)胚乳组织的分离在无菌条件下剥取种子的胚乳组织； (5)胚乳愈伤组织的离体诱导将剥离的胚乳组织接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；所述的诱导培养基为B5培养基+Piculoram 2-5mg/L+6_BA O. 5mg/L+GA3 3mg/L+鹿糖 20g/L+琼脂7g/L，培养条件为24± 1°C条件下暗培养。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊兴耀，李炎林，张家银，石梦蝶，秦宇，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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