梭菌制剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及梭菌制剂及其应用，具体涉及梭菌作为活性成份制成补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，及该微生态制剂通过产生丁酸在治疗相关疾病中的应用，属于生物药领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及真杆菌、梭菌制剂及其应用，具体涉及真杆菌、梭菌単独或组合作为主要活性成份制成补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，及该微生态制剂通过产生丁酸在治疗相关疾病中的应用，属于生物药领域。
技术介绍
丁酸(酪酸)已经被证实是结肠能量的首选来源，提供肠粘膜70%的能量，促进肠粘膜细胞增殖生长及消化系统发育成熟，同时丁酸也是调节免疫的重要物质，丁酸主要来源于肠道产丁酸菌，因此，肠道产丁酸菌虽然不是肠道中数量最多的有益菌，但确是肠道中最重要的有益菌。目前的微生态制剂主要成份包括双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，但均不能产生丁酸，只是单纯地补充肠道有益菌，产生的乳酸、こ酸等要转化为丁酸才能发挥作用，因此治疗相关疾病疗效不是非常理想。目前市场上销售的产生丁酸的酪酸梭菌微生态制剂还是过路菌，不能在肠道长期定植，停药后4天左右就完全排出体外(_述翠，万阜昌，蒲春晓，等.酪酸梭菌在小白鼠肠道内的动态变化研究.中国新药杂志，2002，11 (4) :325-326)，严重影响了疗效的发挥。本专利技术微生态制剂的最大特点和独创之处在于所选菌种为肠道常住有益菌，能够在肠道长期定植，持续产生丁酸，治疗相关疾病疗效显著，社会意义巨大，且未见相关研究报道，特申请此专利技术专利。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，该微生态制剂中的主要活性成份产丁酸菌能在肠道长期定植，持续产生大量丁酸，修复肠粘膜，调节免疫，抑制炎症因子过度表达，同时该微生态制剂还能恢复肠道菌群平衡和提高机体及粘膜免疫，有效治疗消化系统疾病、营养吸收障碍性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、变态反应性疾病、手足ロ病及提高免疫和抗癌。其中所述消化系统疾病包括腹泻、肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肠癌、肿瘤放化疗辅助治疗、腹胀和消化不良、便秘、便臭、便臭中毒综合征、肝胆疾病、病毒性腹泻、喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎、黄疸、口腔溃疡、鹅ロ疮、促进小儿肠道发育成熟、消化吸收、营养保健和生长发育；所述营养吸收障碍性疾病包括佝偻病；所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎；所述心脑血管疾病包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎、动脉粥样硬化；所述变态反应性疾病包括湿疫；所述提高免疫包括治疗反复呼吸道感染。为了达到上述专利技术目的，本专利技术人以对人类及动物健康最重要的肠道常住主要产丁酸菌真杆菌和梭菌为专利技术研究对象。本专利技术的微生态制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备エ艺，公知的能实现的制备エ艺均可以采取含真杆菌或梭菌的样本，优选人或动物粪便，更优选健康婴儿粪便，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入ISmL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无茵操作台内，进行10'10_2、10' 10_4，10_5，10_6，10_7梯度稀释，取10_5，10_6，10_7三个稀释梯度，分别涂布于真杆菌或梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°C下培养48小吋，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小吋。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出各菌种的干燥菌粉，然后进行菌种鉴定、产丁酸实验、肠道长期定植实验和毒性试验，将能产生丁酸和无毒性的真杆菌或梭菌干燥菌粉单独或组合按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊和散剂等各种剂型或饲料添加剤。真杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水IOOmL,胰蛋白胨 lg，酵母浸膏O. 5g,磷酸氢ニ钠O. 4g,葡萄糖O. 15g,可溶性淀粉O. 05g,L-半胱氨酸O. 02g,L-半胱氨酸盐酸盐O. 05g,琼脂I. 5g，调pH值7. 7，115°C，20分钟高压灭菌。灭菌后在冷却到60°C后加入5mL脱纤维马血，ES溶液4mL。其中ES溶液丙酸钠30%，硫酸链霉素4%，硫酸巴龙霉素2 %，硫酸多粘菌素B0. 02%。真杆菌液体扩增培养基优选但不局限干绞碎的牛肉500g，蒸馏水1L，lNNa0H25. OmL，用精牛肉或马肉，绞碎去除脂肪和连接组织，混合肉、水和氢氧化钠煮沸，同时搅拌，冷却至室温，略去表面的脂肪并过滤，保留滤液，补充足够的蒸馏水滤液恢复I升原体积。向姆IOOmL滤液中添加蛋白胨2. 0g、葡萄糖O. 5g、酵母浸膏I. 0g、盐酸半胱氨酸0. 05g、盐溶液4. OmL,维生素K1溶液O. lmL、5mg/mL氯化血红素溶液0. 5mL,调pH至7. 2±0. 1，在厌氧管内通入97 %的氮，3 %的氢，盖紧丁基橡胶瓶塞帽，1210C高压灭菌15min。其中1、盐溶液的配制称取无水氯化钙0. 2g，硫酸镁0. 2g，磷酸氢ニ钾lg，磷酸ニ氢钾lg，碳酸氢钠IOg,氯化钠2g,加蒸懼水至IOOOmL ;2、氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制称取氯化血红素0. 5g溶于lmol/L氢氧化钠ImL中，加蒸馏水至lOOmL，121°C高压灭菌15min，冰箱保存；3、维生素K1溶液的配制称取维生素K1 Ig加无水こ醇99mL，过滤除菌，放冷暗处保存。梭菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水1L，蛋白胨40.0g，Na2HPO4 5. 0g, K2HPO4 I. 0g, NaCl 2. 0g, MgS04 0. Ig,葡萄糖 2. Og,琼脂 25. Og,调 ρΗ7· 6，116°C灭菌20分钟，待其冷至50°C左右，加入卵黄液50. OmL，加入终浓度为200 μ g/mL的硫酸多粘菌素B，加入终浓度200 μ g/mL的新霉素，充分混匀后，分注于平皿中。梭菌液体扩增培养基优选但不局限于纯化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.Og,酵母浸膏3. Og,葡萄糖5. 0g, NaCl 5. Og,可溶性淀粉I. Og,半胱氨酸盐酸盐0. 5g,醋酸钠 3. Og,琼脂 0. 5g，调 ρΗ6· 6-7. 0，121。。，灭菌 15 分钟。为进一歩具体说明本专利技术，专利技术人利用上述方法通过真杆菌选择性单菌落分离固体培养基和梭菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了真杆菌中的直肠真杆菌和柱状真杆菌，梭菌中的第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌，直肠真杆菌、柱状真杆菌、第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌只是作为本专利技术实施说明的优选菌种，本专利技术所述真杆菌和梭菌并不局限于上述四种菌，只要能产生丁酸和无毒性的真杆菌菌种或梭菌菌种均是本专利技术所述，均在本专利技术的保护范围内。其中本专利技术所述的丁酸梭菌来源于肠道，分离于粪便中，能在肠道长期定植，不同于目前在肠道短暂定植的分离于自然界的丁酸梭菌。本专利技术所述直肠真杆菌优选但不限于直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、CGMCC、保存编号2124。本专利技术所述柱状真杆菌优选但不限于柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、CGMCC、保存编号2302。本专利技术所述第三梭菌优选但不限于第三梭菌(Clostridium tertium)、CGMCC、保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种补充肠道产丁酸菌及丁酸的微生态制剂，其特征在于该微生态制剂的活性成份组成为梭菌。2.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于有效剂量的梭菌作为主要活性成份制成药品组合物、保健品、饮品、兽药和饲料添加剤。3.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌指活的生物个体。4.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于ロ服、鼻饲或灌肠应用。5.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于所述梭菌能在肠粘膜长期定植，持续分泌酪酸。6.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不低于I X 106CFU/g。7.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数优选I X 107CFU/g及以上。8.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数优选I X 1012CFU/g及以上。9.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不低于I X 106CFU/mL。10.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数优选I X 107CFU/mL及以上。11.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于梭菌作为药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数优选I X 1012CFU/mL及以上。12.按权利要求I所述梭菌，其特征在于优选第三梭菌和肠道常住丁酸梭菌。13.按权利要求12所述肠道常住丁酸梭菌，其特征在于所述丁酸梭菌能在肠粘膜长期定植，持续分泌酪酸。14.按权利要求2所述梭菌，其特征在于优选第三梭菌QH-07保藏编号CGMCC2304或肠道常住丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303。...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔云龙，李洪福，王发合，张海强，
申请(专利权)人：青岛东海药业有限公司，北京普尔康医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：