具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物本发明专利技术公开了一种利用甲醇酵母表达重组人胰岛素前体，经过纯化、酶切、层析或合成制得的重组人胰岛素及其DesB30类似物，并在其B链第29位赖氨酸的侧链氨基与聚乙二醇以酰胺键偶联而制成的重组人胰岛素及其类似物偶联物的方法。经本发明专利技术制备的重组人胰岛素偶联物具有与胰岛素受体结合率高、持续降血糖效果显著、体内半衰期长的特性，适用于治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体地讲，本专利技术涉及人胰岛素及类似物的重组制备、修饰、纯化及其应用。
技术介绍
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的ー种蛋白质，含有51个氨基酸，分子量约5800，胰岛素分子有靠两个ニ硫键结合的A链(21个氨基酸)与B链(30个氨基酸)，如果ニ硫键被打开则失去 活性。B细胞先合成ー个大分子的前胰岛素原，以后加工成八十六肽的胰岛素原，再经水解成为胰岛素与连接肽。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程1、促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖异生，降低血糖；2、促进脂肪酸合成和脂肪贮存，減少脂肪分解；3、促进氨基酸进入细胞，増加蛋白质合成速度。糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是ー种胰腺功能病变的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素(Insulin)分泌或作用缺陷引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，其主要特征是高血糖。主要分为两种病型I型(IDDM)，胰岛素绝对不足引起；II型(NIDDM)，胰岛素相对不足引起。糖尿病已成为一种常见病、多发病，且成为继癌症、心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病。胰岛素通过与体内细胞膜上胰岛素受体的相互作用，调节血糖維持在正常水平，是最有效的糖尿病治疗药物之一。胰岛素受体是一种四聚体的跨膜糖蛋白，由两个α亚基和两个β亚基通过ニ硫键连接。两个α亚基位于细胞质膜的外侧，有胰岛素结合位点；两个β亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。当胰岛素与受体的α亚基结合时，改变β亚基的构型，酪氨酸蛋白激酶被激活，激活后催化两个反应①使四聚体复合物中β亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化，即自我磷酸化；②磷酸化的酪氨酸残基IRSs结合并激活第二信使，放大、级联信号，引起代谢调节。胰岛素与受体结合的程度取决于受体数目与亲和力，此二者又受血浆胰岛素浓度调节。当胰岛素浓度增高时胰岛素受体数下降，即下降调节。肥胖的非胰岛素依赖型糖尿病人由于脂 肪细胞膜上受体数下降，对胰岛素不敏感性，称胰岛素抵抗。经饮食控制、体育锻炼后体重减轻，脂肪细胞膜上胰岛素受体数增多，与胰岛素结合力加强而使血糖利用改善，调节血糖恢复到正常水平。胰岛素与受体结合率越高，调节血糖的效果越明显，结合率的检测采用竞争结合试验法受体与I125-胰岛素一起孵育，在反应体系中加或不加饱和浓度的未标记的待测胰岛素(或胰岛素类似物)，放射性标记和未标记的待测胰岛素一起得到总的胰岛素结合量，単独加入放射性标记的I125-胰岛素得到非特异性结合量。总结合量减去非特异性结合量得到胰岛素的特异性结合量，特异性结合量除以反应体系中胰岛素总浓度得到特异性结合率。竞争结合试验中的受体优选经过麦胚凝集素-琼脂糖凝胶柱(WGA)层析后得到的大鼠肝脏的胰岛素受体，原因是大鼠肝脏中胰岛素受体含量高，提取方便，且与胰岛素受体高度同源的胰岛素样生长因子-1受体在肝脏中的表达水平低，对检测干扰极小(马歇克等著蛋白质纯化与鉴定实验指南.科学出版社，1999，P141-192;程宁莉等.新生小牛肝组织胰岛素受体的功能·上海第二医科大学学报，1997，12 (2) :23-25 ；Sinha MK. Subunitstructure， autophosphorylation, ana tyrosine-specific protein kinase activityof hepatic insulin receptors in fetal，neonatal，and adult rats. Diabetes,1987 ；36(1) :1161) o正常人体内胰岛素的生理分泌受血糖浓度的调控，进餐后的30-60分钟后血胰岛素浓度达到峰值，2-4小时后恢复到正常值，保证了血糖浓度不因进餐而又引起较大的波动。糖尿病患者皮下注射天然人胰岛素后，胰岛素在注射位置扩散并进入体内循环发挥作 用，但有效作用时间短；频繁地注射胰岛素，也给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，临床上需要注射有效时间更长的长效胰岛素。化学修饰是获得长效胰岛素的途径之一，经过化学修饰，可使胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长，抗原性降低。化学修饰剂的结构必须稳定、无毒性、无抗原性并具有合适大小的分子量。聚こニ醇(PEG)是ー种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒性。PEG若与目的蛋白质结合，需要对PEG分子一端或两端进行活化，根据要连接分子的特性来选择所需要的功能基团。常见的生物相容连接基团包括酷基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、琥珀酰亚胺基(例如琥珀酰亚胺基琥珀酰酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SSA)、N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、环氧基)、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。活化后的PEG理论上可以与蛋白质中主要的氨基酸如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等反应，反应可以在N端，也可在C端，但选择和赖氨酸或N端的基团反应最常见。重组人胰岛素或类似物分子中有三个裸露的氨基，即GlyA1 (pKa 8. 0)、PheB1 (pKa < 7. 0)的0-氨基和1^成29( 1^ 9.5)的氨基，都可作为胰岛素的化学修饰位点。由于人胰岛素的Β29位不直接參与与受体结合，与人胰岛素LysB29的共价修饰不会影响蛋白的生物活性(Murray-Rust J et al.，BioEssaysl992，14 (5) :325-331)。在 pH 值>9. 5 时LysB29上ε -氨基的修饰是主要的，且修饰率高(Hinds K et al. ,Bioconjug Chem 2000,11(2) =195-201) ο郁正艳等(CN200410089050. 8)专利技术了一种单甲氧基聚こニ醇-胰岛素复合物，胰岛素和单甲氧基聚こニ醇通过前者的游离氨基和后者的具有活性的丙醛基团连接在一起，分子量介于10. 8 25. 8KD，但修饰エ艺复杂，且为修饰混合物。印春华等(CN200610118923. 2)专利技术了一种单修饰的聚こニ醇化胰岛素(PheBl-PEG-胰岛素)，聚こニ醇与胰岛素的B链第一位Phe以碳氮键相连，分子量范围6. 55 10. 8KD，但在体内作用时间短，降血糖效果不明显。专利CN1964899A公开了将含马来酸基团的PEG修饰胰岛素的B29，给药后与体内白蛋白结合的长效胰岛素衍生物。专利CN10721712A公开了ー种双 链聚こニ醇修饰胰岛素B30复合物的方法；专利CN101573173A公开了 PEG化延长的胰岛素，其主要修饰A21和或B30的C末端羧基的PEG化，以及Al、BI的N末端氨基的PEG化；专利CN101045166A公开了ー种化学修饰胰岛素的肺部给药，该专利中化学修饰胰岛素包括Al、BI、B29的至少ー个位点的聚こニ醇修饰；专利CN101743252A公开了蛋白酶稳定的PEG化的胰岛素类似物，该专利中的胰岛素类似物具有不同人胰岛素的结构，要求至少含有两个疏水氨基酸被亲水氨基酸取代，然后再进行B29赖氨酸的PEG化，并实现肺部给药的目的。专利CN 200810232本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.本专利涉及具有与胰岛素受体高结合率和体内持续降血糖作用的重组人胰岛素及DesB30类似物的B链第29位赖氨酸ε氨基共价结合聚こニ醇的偶联物。2.权利要求I所述重组人胰岛素及DesB30类似物具有SEQID NO :I和SEQ ID NO 2的氨基酸序列特征。3.权利要求I所述的偶联物，其中连接基团通过包括但不限于酰胺键、氨酯键、仲胺键与重组人胰岛素及DesB30类似物的B链第29位赖氨酸ε氨基连接，优选酰胺键。4.权利要求I所述的聚こニ醇，其特征在于聚こニ醇为单甲氧基聚こニ醇琥珀酸亚胺基丙酸酯(mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA),或单甲氧基聚こニ醇琥拍酰亚胺酯(mPEG-succinimidyl esters, mPEG-NHS),或单甲氧基聚こニ醇三氯苯碳酸酯(mPEG-trichlorophenyl-carbonate, mPEG-TCP),或单甲氧基聚こニ 醇丁醒(mPEG-aldehyde，mPEG-A...
【专利技术属性】
技术研发人员：范开，曹宇，陈勇，李红亮，陈海容，万颖，
申请(专利权)人：重庆富进生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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