一种蝉拟青霉菌株的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo.3453的方法，包括下列步骤：提取待检菌株的DNA；对待检菌株DNA分别采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06进行PCR扩增：获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAPD条带图谱；将获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定结果。采用本发明专利技术的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo.3453，并且不受环境影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利涉及分子生物学
，具体涉及保藏号为CGMCC No. 3453的蝉拟青霉菌株的鉴定方法。
技术介绍
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是ー种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝶棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝶卓 Cordyceps cicadae,基生_束抱 Isaria basiIi,羊克籴球壳抱 Sphaeria sinclairii, 丛生虫壳菌Torrubia caespitosa,辛克莱虫草Cordyceps sinclairii,哈里棒束抱Isariahariottii,小蝶鸾Cordyceps sobolifera,辛克莱棒束抱 Isaria sinclairii,蒙克苏棒束抱 Isaria mokanshawii 和多枝棒束抱 Isaria arbuscula 等等。蝶拟青霉的有性阶段被认为是大蝶草Cordyceps cicadae,在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。常采到的是蝉拟青霉及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉拟青霉寄生后的虫菌复合体。蝉拟青霉属半知菌类真菌，其孢梗束自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长I. 5 8. O厘米，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。本专利技术所涉及的蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为 CGMCC No. 3453。该蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]采用如下方法进行分离从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在浄化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22°C -25°C下培养120h后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22°C _25°C下培养并经反复纯化即可得本专利技术所述的虫单拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 属于半知菌亚门Deuteromycotina,丝抱纲Hyphomycetes,束梗抱目Stilbellales,束梗抱科Stilbellaceae,拟青霉属Paecilomyces。其主要形态特征为在PDA培养基上25°C培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，背面浅黄色，直径5 6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽I. 2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，宽3. O 5. 5 μ m，由每轮2 5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6. 5 8. 8( 11. O) X2. 5 3. 5 μ m。蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCC No. 3453 经试验证实其培养物具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血月旨、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补強壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的エ业化应用价值。由于地理来源不同、寄主不同的蝉拟青霉菌株，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。但是现有的蝉拟青霉鉴定方法是通过菌体形态，生长特性及生理反应的特征进行鉴定的，这些形态学鉴定的方法受环境因素影响，难以对形态差异较小的种间和种内菌株加以鉴别。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用RAPD (random amplified polymorphic DNA随机扩增多态性DNA标记)技术鉴定蝶拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson CGMCCNo. 3453的方法，以及特定引物和反应条件下蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的RAPD条带图-i'Tfe レ曰。本专利技术公开了一种鉴定 !单拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq. ) SamsonCGMCCNo. 3453的方法，包括下列步骤I)提取待检菌株的DNA ；2)对步骤I)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增S6 TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ；3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAH)条带图谱；4)将步骤3)获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定結果。进ー步的，步骤2)的引物还包括以下引物中的ー种或多种S7 GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。进ー步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应体系如下总体积25ul，DNA样本20-50ng,Mg2+ 50n mol,dNTP 5n mol，引物IOp mol，Taq 酶1. 5U (如 TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液2. 5ul (如TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul。进ー步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应条件如下先95°C 3分钟；而后依次95°C 40秒，560C I分钟，72°C 2分钟，共循环40次；然后72°C延伸5分钟，最后降温至4で。进ー步的，所述步骤4)中，将步骤3)获得的待检菌株RAH)条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较，如两者相似度为95%以上，则鉴定待检菌株为蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq. ) Samson CGMCC No. 3453。所述相似度的计算方法为F = 2NXY/(Νχ+Νγ)*100% (其中F为相似度，Nxy为待检菌株RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较后二者相同的条带数，Nx为待检菌株RAPD条带图谱拥有的条带数，Ny为标准样本的RAPD条带图谱拥有的条带数)。采用本专利技术的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453，并且不受环境影响。附图说明图I :各引物对应的标准样本的RAPD条带图谱I :S6为引物RAPD条带图谱，泳道I为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是:23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，IOOObp,900bp,800bp,700bp，600bp，500bp，400bp。BAOOl 的 RAPD 条带大小估算为 6500 6000bp 之间，5500 4700bp 之间，260本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No. 3453的方法，包括下列步骤 1)提取待检菌株的DNA； 2)对步骤I)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增56TGCTCTGCCC ；SlO CTGCTGGGAC ；S31 CAATCGCCTG ；OPV-14 AGATCCCGCC ；0PW-06 AGGCCCGATG ； 3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAH)条带图谱； 4)将步骤3)获得的待检菌株的RAH)条带图谱与标准样本的RAH)条带图谱比较判定获得鉴定結果。2.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，步骤2)的引物还包括下列引物中的ー种或多种57GGTGACGCAG ；S33 CAGCACCCAC ；S69 CTCACCGTCC ；0PC-10 TGTCTGGGTG ；0PF-06 GGGAATTCGG ；0PG-03 GAGCCCTCCA ；OPH-18 GAATCGGCCA ；0PH-20 :GGGAGACATC。3.如权利要求I所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCCNo. 3453的方法，其特征在于，所述步骤2)所采用的PCR扩增反...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏宁，鲍晓妮，江三多，张健，陈超，孙长胜，
申请(专利权)人：上海泛亚生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：