用于抗血管生成治疗的双特异性结合分子制造技术

本发明专利技术涉及双特异性结合分子，特别是免疫球蛋白单一可变域，例如VHH及域抗体，其在一个分子中包含VEGF结合组分及Dll4结合组分。本发明专利技术涉及含有所述双特异性结合分子的药物组合物，及其在治疗与VEGF和Dll4介导的血管生成作用相关的疾病的用途。本发明专利技术涉及编码所述双特异性结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类治疗的领域，尤其是癌症治疗的领域，以及适于该治疗中的药物和组合物。现有技术如US 2008/0014196中所概述 ，血管生成涉及于大量疾病(包括实体瘤及转移)的发病机制中。在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成以及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人，Nature 339-58 (1989)),这使肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。最重要的促血管生成因子之一为血管内皮生长因子(VEGF-A，以下称为“VEGF”)，其属于包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D及VEGF-E的基因家族，并且以由替代性拼接单一基因的mRNA产生的若干同工型形式存在，VEGF165为生物学上最相关的同工型。因此，大多数依赖抗血管生成的抗癌治疗已集中于阻断VEGF路径(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004 年 5 月；3(5):391-400)。近来，D114(或Delta样4或delta样配体4)已鉴定为癌症治疗的有希望的靶点。D114为Notch配体的Delta家族成员。Notch信号传导在许多癌症中，例如在T细胞急性淋巴母细胞白血病中及在实体肿瘤中调控异常(Sharma等人，2007，Cell Cycle6 (8) : 927-30 ；Shih 等人，Cancer Res. 2007 年 3 月 I 日；67 (5) : 1879-82)。D114的细胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)域、及一串八个表皮生长因子(EGF)样重复构成。一般而言，认为EGF域包含氨基酸残基218-251 (EGF-1 ;域I)、252-282 (EGF-2 ;域 2)、284-322 (EGF-3 ;域 3)、324-360 (EGF-4 ;域 4)及 362-400 (EGF-5 ;域5)，同时DSL域在hDl 14的约氨基酸残基173-217处，并且N-末端域在约氨基酸残基27-172处(W0 2008/076379)。已报导D114由血管内皮高度选择性表达，特别是在动脉内皮中高度选择性表达(Shutter 等人，(2000)Genes Develop. 14:1313-1318)。近来在小鼠中的研究已显示，D114由VEGF诱导且为限制血管萌芽及分枝的负反馈调节子。与此作用一致，缺失或抑制D114会导致血管生成过度(Scehnet等人，Blood. 2007年6月I日;109 (11) :4753-60)。这种不受限制的血管生成由于非生产性(non-productive)血管的形成而反常地减缓肿瘤生长，即使在对抗VEGF治疗具有抗性的肿瘤中也是如此(Thurston等人，Nat Rev Cancer. 2007年5 月；7(5) :327-31 ；W0 2007/070671 ；Noguera-Troise 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122))。除对肿瘤血管生成的作用外，抑制D114还显示降低临床前肿瘤模型中癌干细胞的频率(Hoey 等人，Cell Stem Cell. 2009 年 8 月 7 日；5 (2) : 168-77)。已公开的处于临床(前)研发中的若干靶向D114的生物化合物有REGN-421 ( = SAR153192 ;Regeneron，Sanofi-Aventis ;W0 2008076379)及0PM-21M18 (OncoMed) (Hoey 等人，Cell Stem Cell. 2009 年 8 月 7 日；5 (2) : 168-77)，两者均为完全人 D114 抗体；YW152F (Genentech),—种人化 D114 抗体(Ridgway 等人，Nature. 2006年 12 月 21 日；444 (7122) :1083-7) ;D114_Fc (Regeneron，Sanofi-Aventis)，一种由 D114 细胞外区域及人IgGl的Fe区域构成的重组融合蛋白(Noguera-Troise等人，Nature. 2006年 12 月 21 日；444(7122))ο已显示在多个肿瘤类型的异种移植模型中及在抗VEGF抗性肿瘤模型中，相比于单独的抗VEGF,VEGF与D114的组合抑制会提供优越的抗肿瘤活性(Noguera-Troise等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1032-7 ；Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21H ；444(7122):1083-7 ；US2008175847)。单克隆抗体(MAb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以其不适于口服给药。MAb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度较低以及不能靶向于肿瘤中的所有细胞。此外，基于靶向VEGF及D114两者的现有技术的治疗代表了涉及两种单独的抑制剂(即VEGF结合分子和独立的D114结合分子)的组合治疗。然而，这些治疗具有以下缺点两种独立药物的研发及生产涉及高成本和大量资源，两种药物可能具有不同药代动力学性质，以及给予两种药物对患者造成不便。鉴于以上所述，本专利技术的一个目标在于提供用于人类抗肿瘤治疗的改良分子。本专利技术基于将一个或多个VEGF结合分子与一个或多个D114结合分子合并在单一治疗剂中的概念。因此，本专利技术涉及包含一个或多个D114结合分子与一个或多个VEGF结合分子的双特异性结合分子。在下文中，除非另有说明，则术语“结合分子”(或“抗原结合分子”)是指D114结合分子(特别是免疫球蛋白单一可变域)或VEGF结合分子(特别是免疫球蛋白单一可变域)或两者。术语“双特异性结合分子”是指包含至少一个D114结合分子(或“结合组分”)和至少一个VEGF结合分子(或结合组分)的分子。双特异性结合分子在结合Dl 14或VEGF的分子部分中，即分别在其“D114结合组分”(或抗D114组分)或“VEGF结合组分”(或抗VEGF组分)中，可含有一个以上Dl 14结合分子和/或一个以上VEGF结合分子，即在双特异性结合分子含有双互补位(biparatopic,如下文所定义)D114结合分子和/或双互补位VEGF结合分子的情况下。本专利技术的双特异性结合分子适于用作预防、治疗、减轻和/或诊断可通过抑制D114而调节的疾病或病症(例如癌症)的组合物中的药理学活性剂。本专利技术的另一目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或症状的方法，其涉及使用和/或给予这些药物及组合物。特别地，本专利技术的一个目标在于提供所述药理学活性剂、组合物和/或方法，其相比于当前使用的和/或本领域中已知的药物、组合物和/或方法可提供某些优势。尤其相比于如上所述的常规抗体或其片段，这些优势包括治疗性质和/或药理学性质得到改良和/或其他(例如)对于制造目的而言有利的性质。 更具体地，本专利技术的一个目标在于提供新分子，且具体为结合哺乳动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.02 EP 09172137.3;2010.09.03 EP 10175316.81.一种双特异性结合分子，其包含D114结合组分及VEGF结合组分。2.权利要求I的双特异性结合分子，其中该D114结合组分和该VEGF结合组分分别包含至少一个D114结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域。3.权利要求2的双特异性结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。4.权利要求2或3的双特异性结合分子，其中该VEGF结合组分位于N端。5.权利要求2至4中任一项的双特异性结合分子，其中该Dl14结合组分和该VEGF结合组分分别包含至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个Dl 14结合免疫球蛋白单一可变域，其中每一个所述免疫球蛋白单一可变域具有四个框架区和三个分别为CDR1、⑶R2和⑶R3的互补决定区， 其中 a)所述至少一个D114结合免疫球蛋白单一可变域的CDR3具有选自以下的氨基酸序列i.如SEQ ID NO: I 中所不的 Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro TyrXaa Tyr AspXaa，其中 位置8的Xaa为Arg、Ala或Glu ； 位置11的Xaa为Leu或Glu ;及 位置14的Xaa为Tyr或His ;及 ii.如SEQ ID N0:2 中所不的 Asp Arg Tyr He Trp Ala Arg Gln Gly GluTyr TrpGly Ala Tyr Xaa Asp Tyr,其中 Xaa 为 Gin、Ala 或 Tyr ;且 其中 b)所述至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域的⑶R3具有如SEQID NO: 3中所不的氨基酸序列 Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu AlaAsp Thr Tyr XaaTyr,其中 Xaa 为 Asp 或 Glu, 其中该VEGF结合免疫球蛋白单一可变域能够以彡60%的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2的相互作用。6.权利要求5的双特异性结合分子，其中该免疫球蛋白单一可变域为VHH，其由亲本免疫球蛋白单一可变域VHH任选在亲和力成熟后进行序列最优化而获得。7.权利要求6的双特异性结合分子，其中所述结合D114的VHH从具有氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-20及表5中所示序列的亲本VHH获得。8.权利要求7的双特异性结合分子，其中该亲本VHH具有SEQID N0:10中所示的氨基酸序列。9.权利要求8的双特异性结合分子，其中所述结合D114的VHH由具有SEQID NO: 10中所示序列的VHH衍生的亲和力成熟的VHH进行序列最优化而获得，其中该亲和力成熟的VHH选自具有SEQ ID NO: 21-27及表16中所示的氨基酸序列的VHH。10.权利要求9的双特异性结合分子，其中该亲和力成熟的VHH具有SEQID N0:22中所示的氨基酸序列，且其中该序列最优化的VHH具有选自SEQ ID NO: 34及35以及表23中所示序列的氨基酸序列。11.权利要求7的双特异性结合分子，其中该亲本VHH具有SEQID NO: 12中所示的氨基酸序列。12.权利要求11的双特异性结合分子，其中所述结合D114的VHH已由具有SEQIDNO: 12中所示序列的VHH衍生的...

【专利技术属性】
技术研发人员：E伯吉斯，A格什温，J鲍克尼厄，E德塔沃尼尔，J科尔克曼，P麦切尔斯，D范胡里克，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆国际有限公司，
类型：发明
国别省市：