高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体及其制备方法和应用。通过对组织因子与Ｘ因子的结合位点进行生物信息学和抗原免疫原性分析，寻找免疫原性好且包括关系着组织因子与Ｘ因子结合的关键氨基酸残基的氨基酸序列，制备成组织因子多抗原肽，以此多肽免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，获得具有高效抗凝活性的小鼠抗人组织因子单克隆抗体，能在血栓病治疗和与ＴＦ相关的疾病诊断中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体及其 制备方法和应用。
技术介绍
正常人体中，血管内的促凝血和抗凝血活性保持着适当的平衡。在动脉粥样 硬化、高血压、高血脂、糖尿病等病理因素的影响下，该平衡可能向促凝血方向 倾斜，最终导致血栓形成，引起急性心肌梗死、急性脑梗死和急性肺栓塞等危及 生命的疾病。因此需要有效、安全的抗凝血剂来治疗特殊的血栓性疾病。组织因子(tissue factor, TF)是一个跨膜糖蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞 内区三个部分。在正常生理条件下，TF不和血液接触。只有当血管受损时，暴 露于血管内皮下的TF及胶原将导致凝血因子和血小板的活化并随后形成止血栓 子。TF既是凝血因子VII(FVII)在细胞表面的受体，又是FVII或激活的FVn(FVII a)的辅因子，能进一步催化激活凝血因子X (FX)和IX，这两种因子分别是内源 性凝血途径和凝血酶原复合物的关键成分，可导致凝血酶的快速形成。凝血酶将 纤维蛋白原降解为纤维蛋白，后者随之聚合成纤维蛋白凝块。TF广泛存在于动 脉粥样硬化斑块的细胞和非细胞成分中，斑块的破裂使其核心中有活性的TF暴 露于循环血液，这是造成急性血栓形成的重要原因。针对动脉血栓性疾病，现有技术已经研制了众多的抗凝血药物，包括肝素类 药物、血小板聚集抑制物、凝血酶抑制剂等。上述药物所针对的靶蛋白均位于凝 血途径的中下游，理论和实践上都达不到最理想的抗凝效果，且这些靶点蛋白在 正常血液循环中，都有一定量的生理浓度，在疾病状态使用这些药物时，由于可 能出现过度抑制，因此可能发生出血等不良反应。虽然人体内存在TF的天然抑制物一组织因子途径抑制物(TFPI)，但TFPI 不仅能够抑制TF，还有抗炎作用。也就是说，如果使用TFPI治疗血管损伤引起 的血栓性疾病，TFPI的抗炎作用有可能成为不良反应。此外，TFPI在血液循环 中的半衰期甚短，使用时所需剂量极大。因此，研制TF单克隆抗体即可以克服TFPI针对性不强和半衰期甚短的缺点，同时也可为血栓病的治疗提供新的手段。抗人TF单克隆抗体是否具有抗凝活性，与TF单抗和TF抗原亲和力的强弱关 系不大，而是取决于TF单抗是否封闭了TF与相互作用的凝血因子的结合部位。 TF与FVII结合形成的复合物除了具有启动凝血途径的作用以外，还具有广泛的 信号转导作用，是重要的细胞增殖信号复合物。因此，如果抗人TF单抗阻碍了 TF与FVII的结合，可能会导致一系列的生理功能紊乱。如果仅是针对TF和FX结 合部位的单克隆抗体则能阻止TF/FVIIa复合物的凝血激活作用，对iH常的生理功 能影响甚小。迄今，尚未见有关具有高效抗凝活性的抗TF单克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的具有高效抗凝作用的抗人组织因子单克隆 抗体及其制备方法。所述的单克隆抗体是由组织因子多抗原肽(TF-MAP)免疫制备的鼠源单克隆抗体。本专利技术的另一目的是提供所述的抗人组织因子单克隆抗体在血栓病治疗和 与TF相关的疾病诊断中的应用。本专利技术综合应用蛋白质结构生物学、生物信息学、抗体工程等技术，获得了 具有高效抗凝活性的抗TF单克隆抗体，能在血栓病治疗和与TF相关的疾病诊断 中发挥重要作用。本专利技术通过特异的多抗原肽免疫小鼠，制备具有高效抗凝血功能的抗人组织 因子单克隆抗体。本专利技术首先运用疏水性、柔韧性、同源性和空间结构抗原表位预测分析等方 法，寻找并确定了TF与FX相互作用区域的氨基酸序列(TFP)。将此序列采用化 学合成的方法在多聚赖氨酸介质进行人工合成，形成TF-MAP。 本专利技术提供了一种识别人组织因子可预测表位的单克隆抗体。 本专利技术提供了一种杂交瘤，它产生识别人组织因子可预测表位的单克隆抗体。本专利技术的杂交瘤优选TF 4A12。由本专利技术的杂交瘤产生的单克隆抗体构成了本专利技术的一个方面。专利技术详述本专利技术的单克隆抗体识别人TF抗原。本专利技术的单克隆抗体可通过本专利技术的杂交瘤产生，因此是可以从培养本专利技术 的杂交瘤的培养液或用本专利技术的杂交瘤免疫小鼠从其腹水中获得。然而，产生本 专利技术的单克隆抗体的方法不受特别的限制，如果基因工程化的抗体能与人TF特 异性结合，它也在本专利技术的范围内。本专利技术的杂交瘤产生的识别人TF特异性部位的的单克隆抗体，可通过经 TF-MAP免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。本专利技术的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。因此，用TF-MAP 作为免疫原免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细 胞融合，产生杂交瘤，从其中选出识别人TF及TF-MAP的单克隆抗体的杂交瘤， 从而获得了本专利技术的杂交瘤。所述的TF-MAP中的TFP不受特别限制，可以是来源于FX与TF的结合位点区 域一TF咖.240，经疏水性，柔韧性，同源性以及空间结构的抗原表位预测分析后， 满足条件的任何的TFP。所述的TFP采用化学合成的方法进行人工合成，如Fmoc (9-芴甲氧羰基)保 护残基法。所述的TF-MAP是将TFP化学合成在特殊的介质上，如球型多聚赖氨酰介质。经免疫产生本专利技术的杂交瘤的动物不受特别的限制，但包括例如山羊、绵 羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。但其中优选的是小鼠。可用任何本领域已知的方法免疫上述要免疫的动物。在免疫小鼠中，例如， 可能提到的方法包括将TF—MAP(约250u g)与等体积的福氏完全佐剂混合后作为 TF抗原，向6—8周龄的Balb/c系雄性小鼠的皮下多点进行免疫，于免疫后第12、 25和32日，使用与福氏不完全佐剂混合的TF—MAP，以250 u g /小鼠的量向小鼠 皮下进行追加免疫，作为最终免疫，于第45闩以250"g/小鼠的量向腹腔内注入 用PBS稀释的TF抗原溶液。本专利技术的实践中，免疫上述动物后选择抗体滴度高的个体，最终免疫3 — 5 日后切下它们每一只的脾脏或淋巴结，将这些组织中所含的产生抗体的细胞与骨 髓瘤细胞，通过本领域已知的细胞融合法，在融合促进剂存在下融合，制备杂交 瘤细胞株。上述融合促进剂不受特别的限制，但包括例如聚乙二醇(PEG)，仙台病毒 等。然而PEG是优选的。上述骨髓瘤细胞不受特别限制，但首选SP2/0骨髓瘤细胞。上述细胞融合方法不受特别限制，但可以包括方法以1:1一1:10之比混合脾 细胞和骨髓瘤细胞，加入分子量为1，000 —6,000的PEG至浓度10 — 80。/。，在20— 37°C，优选30—37。C下孵育该混合物3—10分钟。在本专利技术的实施中，产生识别人TF特异性位点的单克隆抗体的杂交瘤的选 择，可通过在杂交瘤单独能生长的选择培养基(如HAT培养基)上培养杂交瘤， 并采用不同抗原的ELISA法进行筛选，如抗原为TF-MAP、 TFl，等。大量制备本专利技术的单克隆抗体的方法不受特别限制，方法可以是例如将杂 交瘤移植到预先施用降植烷或石蜡油的小鼠腹腔中，回收腹水并从其获得抗体。 可通过本领域己知的方法，用蛋白A柱或蛋白G柱等纯化腹水中的单克隆抗体。本专利技术所制备的单克隆抗体进行抗原抗体反应的鉴定方法不受限制，如采用 免疫印迹法或细胞免疫荧光实验。本专利技术所制备的单克隆抗体进行抗凝活性鉴定的方法不受特别限制，如稀释 凝血酶原时间、FX发色底物法等。本专利技术利用生本文档来自技高网...

【技术保护点】
高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体，其特征在于，通过组织因子多抗原肽免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，所获单克隆抗体具有高效抗凝活性，所述杂交瘤细胞是ＴＦ　　４Ａ１２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马端，蔡旭，刘静，彭卓醇，孔德升，李笑天，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]