使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法，尤其涉及一种生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括培养有产油能力的微生物，从而在微生物内积累大量油，诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸，并且将游离脂肪酸转变成烷基酯。根据本发明专利技术方法，可以通过代谢工程方法将在微生物中积累的油，例如甘油三酯(典型的通过微生物产生的油)，高效转化为脂肪酸烷基酯。因此，本发明专利技术方法可用于脂肪酸烷基酯(最近发现可作为有效的生物柴油)的工业生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及ー种，尤其涉及一种生产脂肪酸烷基酯的方法，所述方法包括培养有产油能力的微生物，从而在微生物内积累大量油，诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸，并且将该游离脂肪酸转变成烷
技术介绍
近来，由于高油价以及环境方面的考虑，微生物生产生物燃料受到了极大关注。此外，生物柴油已经取代轻油或者出现了生物柴油和轻油的混合物作为替代燃料应用于柴油发动机，因此生物柴油的市场迅速扩大。2008年，欧盟(EU)生产了 660万吨生物柴油，市场份额为 55 亿欧元(Biodiesel Market, Frost&Sullivan)。另外，2006 年美国生产了 30 亿加仑生物柴油(Biodiesel Market, Global Industry Analysts Inc，2006.5)。生物柴油的优势在于其具有高燃烧率，因而有毒气体排放量低，较之轻油热值约低10%，但燃点更高，表明其在存储和运输期间更为稳定。生物柴油主要是通过处理动物和植物的脂肪成分来生产，从而使其具有类似于轻油的性质，或者通过植物油脂(米糠、烹饪废油、大豆油、菜籽油等等)与乙醇反应而制得。然而，在这种情况下的缺点是难以大量生产生物柴油。因此，如果能通过使用微生物大量生产生物柴油作为轻油的代用燃料，将减少原油的进ロ及温室气体的排放，使得环境改善。同吋，油是ー种能量载体，当微生物富有碳源而缺乏其它生长因子(氮、磷、氧、 硫、等等)吋，油可在微生物細胞内合成并积累。当微生物的生长环境改变，而向微生物提供其它生长因子吋，所积累的油将被降解并且用作能源。众所周知，由于产油微生物的种类、所提供的化学原料的种类、培养条件等的不同，油可由超过100种单体組成。近来，已经开发了向植物(如甘蔗)脂肪酸中添加醇来生产脂肪酸烷基酯的技木， 所生产的脂肪酸烷基酯目前正被用作生物柴油。此外，欧洲专利EP127104A、EP184740A和美国专利4，164，506中也公开了酯化游离脂肪酸的方法。根据这些专利的公开内容，酷化反应通过加热脂肪酸和甘油三酯以及甲醇的混合物来进行。另外，欧洲专利申请EP708813A 公开了ー种提高油脂生产脂肪酸烷基酯的产量的方法，其中将游离脂肪酸与酷交換得到的甘油分离，然后进行酯化。然而，很难用这种方法获得大量脂肪酸或者游离脂肪酸。另外，由于植物的生长期很长而且生产植物脂肪酸的代谢工程方法有些困难，因而很难増加目前常用的植物脂肪酸的积累和产生。因此，本专利技术人通过大量努力，提出了ー种通过代谢工程途径高效且高产地生产被用作生物柴油的脂肪酸烷基酯的新方法，并且结果发现使用代谢工程方法，通过使产油微生物最大化地生产油，然后诱导微生物中的油自溶生产游离脂肪酸，然后游离脂肪酸转变为烷基酷，可高效生产脂肪酸烷基酷，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种通过代谢工程途径高效且高产地大量生产可用作生物柴油的脂肪酸烷基酯的新方法。为了达到上述目标，本专利技术提供一种生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力的微生物以生产油；(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸；以及(c)向所生产的游离脂肪酸中添加醇，并且使醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸烷基酷。本专利技术还提供了ー种使用有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物来生产脂肪酸甲酯的方法，该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物以生产油；(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸；以及(c)向所生产的游离脂肪酸中添加甲醇，并且使甲醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸甲酷。本专利技术的其他特征和实施例在下文的详细说明和附加权利要求中显而易见。 附图说明图1示出用不透明红球菌(Rhodococcus opacus) PD630从典型油(甘油三酯TAG) 高效生产脂肪酸甲酯的方法。图2示出重组载体rpR0UC18 (a)和rpR0UC18_KM(b)的遗传图谱。图3示出包含sdpl和MSMEG_0220基因的重组载体pRUCSdpMag的遗传图谱。图4示出基于表1所示的信息得到的质粒的类型和信息。图5示出游离脂肪酸的气相色谱分析結果。图6和7示出脂肪酸甲酯的气相色谱分析結果。具体实施例方式除非另行定义，否则在此使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员所通常理解的相同。在此使用的命名法和实验方法是本领域众所周知并且经常使用的。专利技术详述中的主要术语的定义如下。如在此使用，术语"油"是指ー种能量载体，当微生物富有碳源而缺乏其它生长因子(氮、磷、氧、硫、等等)吋，其可在微生物細胞内合成并积累。它是ー种游离脂肪酸前体，可水解为游离脂肪酸和甘油。如在此使用，术语"脂肪酸"指饱和或者不饱和的单羧酸类型的链。这些脂肪酸根据碳链长度和饱和度进行分类，油(即，脂肪)水解而产生的脂肪酸被称为"游离脂肪酸〃。一方面，本专利技术涉及ー种，尤其涉及ー种生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力的微生物以生产油；(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸；并且(c)向所生产的游离脂肪酸中添加醇，并且使醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸烷基酷。在本专利技术中，油可以是微生物生产的任何油，其实例包括但不限干，甘油三酯 (TAG)、ニ酰甘油(DAG)、单酰甘油(MAG)、磷脂、留醇类脂、鞘脂类、糖脂、异戊烯醇类脂以及聚酮化合物。在此，通过分解油而产生的游离脂肪酸可以是饱和或者不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸指具有一个或多个碳链内双键的脂肪酸，其实例包括油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、蓖麻油酸、1ト十八碳烯酸、顺9- 二十碳烯酸、花生四烯酸、EPA(5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸)、芥子酸、DHM4，7，10，13，16，19-二十ニ碳六烯酸)等。另外，饱和脂肪酸指没有碳链内双键的脂肪酸，其实例包括丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、正廿ニ烷酸、二十四(烷)酸等。用于本专利技术的脂肪酸可被选自下述基团的取代基取代，包括但不限于芳环基、环氧基、氰基基团和卤素基团。在本专利技术中，作为游离脂肪酸的前体的油是由有产油能力的微生物生产的。有产油能力的微生物包括气单胞菌属(Aeromonas sp.)、无色杆菌(AchromcAacter sp.)、 德氏食酸菌(Acidovorax delaf ieldii)、敏捷食酸菌(Acidovax facilis)、不动细菌属 (Acinetobacter 8卩.)、放线菌ノ禺(Actinomyces 8卩.)、气单胞|6|)|| (Aeromonas sp·)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、父替单胞菌属(Alteromonas sp.、破囊壶菌属(Althornia sp.) > Aplanochytrium sp. > % M ) (Aspergillus sp·)、ロ变杆菌偶(Amoeoobacter sp·)、隐球蓝细菌属(Aphanocapsa sp.)、隐杆蓝细菌属(Aphanothece sp.)、自养水螺菌 (Aquaspirillum autotrophicumノ、差瘤固風t艮瘤菌(Azorhizobium caulinodansノ、固氣螺菌偶(Azospiri本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，崔龙俊，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：