一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法，本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现Bt融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括：1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；2)采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现Bt融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；幻采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。
技术介绍
Bt是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称，属革兰氏阳性上壤芽胞杆菌。该细菌产生的Bt杀虫毒蛋白能够破坏昆虫肠道内的细胞渗透压，造成消化紊乱， 最终导致昆虫死亡。Bt基因是第一代抗虫基因的典型代表，它表达的蛋白统称为Cry晶体蛋白。根据杀虫谱及氨基酸序列同源性的不同，Bt基因被分为不同的类型，其中CrylAb和 CrylAc对鳞翅目害虫具有专一性毒性，而其它的Bt基因则对双翅目或鞘翅目等害虫具有专一毒性。Bt基因通过生物技术手段转入作物后，能够表达具有杀虫活性的毒蛋白并使植物具备抗虫性。目前，国内外已经获得转Bt基因的作物有棉花、水稻、玉米、小麦和油菜等。虽然现在市场上有许多可用于Bt转基因蛋白质测定的试剂盒，但不同的厂商可能采用不同的工艺表达、分离纯化原料，以及不同的方法确定参考物质的量值，而蛋白质检测标准物质和量值溯源传递体系的严重缺乏使得不同试剂盒内所带参考物质不能溯源到上一级的计量标准，也就无法保证不同试剂盒所带参考物质量值的准确性与可溯源性，造成测定结果不准确和缺乏可比性，对生物安全监管带来隐患，由此产生一系列法律、贸易等经济和社会问题。因此，在我国范围内，尽快研制Bt蛋白标准物质，建立起灵敏准确的定量测定方法及Bt转基因植物蛋白量值溯源传递体系，对于今后保证测定结果的溯源性、准确性和可比性，显得十分迫切且意义重大。近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)生物学特性的深入研究，发现其作为外源基因表达宿主的优势逐渐显现。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(Lodeboer A.M.，et al. , 1985) 一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase, M0X)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FMD)作用下生成C02，H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成 H2O和& ；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括Μ0Χ、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0. 时，阳遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80%，M0X和DHAS可占细胞总蛋白的15%，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。目前用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的诱导型启动子都需要在一定剂量甲醇存在的条件下才能发挥作用，但由于甲醇是有毒物质，且易燃易爆，这样就限制了该系统在医药或食品等领域的应用。因此，各种组成型启动子就应运而生，已经成功应用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的组成型启动子有质膜AIPase 启动子(pPMAl)和翻译延伸因子Ia启动子(TEFl)等，这些组成型启动子的应用不仅无需在发酵培养基中加入甲醇，而且也简化了发酵工艺和降低了成本等。汉逊酵母作为外源蛋白表达宿主多采用营养缺陷型菌株来进行重组子的初步筛选，目前已得到多种营养缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(Seon AhCheon, et al.，2009)。同时，由于汉逊酵母对氨基糖苷类抗生素敏感，G418、 Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被广泛地用作筛选标记。以汉逊酵母作为外源基因的表达宿主时，外源DNA整合到酵母基因组中主要可分为随机整合和同源重组，其中同源重组需要导入的DNA中必须含有汉逊酵母的同源序列。 同源序列与酵母基因组中某段DNA序列完全或部分一致，从而导致外源DNA在此位置可通过同源交换整合到酵母基因组中。汉逊酵母转化常用的同源序列包括各种强启动子和 rDNA(Klabunde J. , et al. ,2003)序列，而本专利技术首次采用了汉逊酵母质膜AIPase基因作为同源整合序列。真菌质膜AIPase是上世纪70年代未首次在粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中被发现的，随后分别从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中得到提纯。质膜 ATPase是酵母质膜中含量最多的蛋白，占总质膜蛋白的15%，占总细胞蛋白的0. 3%，它的主要作用是作为一个跨膜的质子泵，维持细胞内的PH值和电化学梯度，从而使多种营养物质得以运输。汉逊酵母质膜AIPase (Helen Cox, 2000)基因全长^97bp，编码898个氨基酸。本专利技术中首次将其插入到汉逊酵母表达载体中作为外源基因整合的同源序列。作为外源基因的表达宿主，汉逊酵母具有许多优点1)汉逊酵母的最适生长温度在37 43°C，菌体生长速度快，发酵时间短；2)以rDNA作为整合的同源序列，可以获得高拷贝的转化子，有可能极大地提高外源重组蛋白的表达量；幻多个外源基因能够通过一步法同时被整合到酵母基因组中，并按照一定剂量关系同时或分别表达。上述优点使汉逊酵母表达系统迅速发展成为最具魅力的真核表达系统之一，目前，已经有多种外源蛋白基因在汉逊酵母中获得了表达，见表1 表1在汉逊酵母中表达的部分外源蛋白外源蛋白来源表达呈文献Glucose oxidase (GOD)Aspergillus neger500mg/L (MOX 启动子) 1 85mg/L (PMA1 启动子)I Ielen Cox,2000Human serum albumin (rHA)Human280mg/L (MOX 启动子) 460mg/L (PMA1 启动子)uricaseCandida utilis2.4g/LZhiyu Chen,e/ c /.,2008BFSHa/ScCnel 融合蛋内’牛4.7mg/LWeidong Qian,( i αι., 2009BFSHp/ScCnel融合蛋白牛6.2mg/'Lα-醇腈酶2.015U/ml张冬冬7，2009人血洁闩蛋闩人1.033本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘德虎，王楠，李刚强，刘树鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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