本发明专利技术公开了一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamHI和Xho?I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，同时提供了该基因片段的表达以及应用。本发明专利技术所述的小反刍兽疫抗原表位疫苗安全、易于生产、便于储藏和使用，能广泛适用于基因工程领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段及其表达、应用。
技术介绍
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)引起的一种严重危害山羊、绵羊等小反刍类动物的传染病，也称小反刍兽伪牛瘟，卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症，山羊高度易感，发病率和病死率均较高。该病在世界上被认为是十分重要的烈性传染病之一，在我国该病也被列为一类动物传染病。1942年，小反刍兽疫在西非的科特迪瓦首次被报道，随后几年里，非洲的大部分国家都报道发生此病。近几年来，小反刍兽疫进一步蔓延，流行趋势日益严峻。在2007 年7月和2010年5月，我国西藏阿里地区发生了该病，对我国动物卫生安全构成了严重威胁。 目前，世界上大多数国家防制Pra主要依赖于疫苗免疫接种。对于已发病的动物没有有效的治疗方法，耐过动物可获得主动免疫。PPRV与RPV在基因上的同源性很高，在过去一般都是采用RPV组织培养疫苗来对PPR进行防疫。表位疫苗属于亚单位疫苗的一种，在设计表位疫苗时，由于表位片段短，表达产物分子量小，为插入合适的免疫增强因子进行共表达提供了可能。最重要的是，表位疫苗不存在基因重组、整合的问题。H蛋白是PPRV上的一种糖蛋白，构成病毒表面的一种纤突。H蛋白刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫。Makoto Sugiyama等研究表明，是PPRV重要的结构蛋白，它主要包含两个中和性抗原表位区域I和II。F蛋白是PPRV病毒表面上的一种纤突，决定病毒能否成功感染，能够诱导产生细胞溶血素、细胞融合、启动病毒感染细胞等生物学活性。H、F蛋白都是PPRV主要的保护性抗原。迄今为止，小反刍兽疫疫苗生产技术虽然几经革新，但是广泛使用的仍是弱毒苗， 虽然DNA疫苗、重组疫苗等的优越性以及所取得的成就引起了广泛关注，但毕竟研究的历史较短，不够深入，在实际应用中不可避免的存在很多问题，如应用对象的安全性问题、免疫耐受性问题等，这些都是表位疫苗有待解决的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，设计并串联了 F、H基因的10个B细胞抗原表位和一个通用T细胞表位，各表位之间以柔性甘氨酸间隔，并在原核系统中进行表达，可用于小反刍兽疫病毒新型疫苗。其技术方案为根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bc印red预测结果，综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。权利要求1.一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，其特征在于，将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5'和3'端分别加入 BamH I和Bio I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，所述抗原表位氨基酸序列为TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV RLNGGGGILAVQGVQDYGGGGTSCVFTPEGGGGPDKLLTVIGGGGYPDSVYLHEIDLGGG GKSYVRSLGGGGAKFVAAffTLKAAA 所述推导出的核苷酸序列为GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGACAGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCCGGTGGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTACTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAAGACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTGATAAACTACTAACTGTTATAGGTGGGGGTGGTTACCCAGATTCTGTATACCTACATGAAATAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG。2.—种权利要求1所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法，其特征在于，表达载体的构建将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和)(h0 I双酶切，回收酶切片段，连接，构建PET30a (+)表达载体，连接产物转化DH5a，挑取单菌落接种LB液体培养基，扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体，经过测序，证实阅读框架正确，重组质粒命名为 PET30a-Bff ；重组蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液，37°C振荡培养至培养液OD600达0. 6-0. 8时，加入终浓度为0. 2mol/L 1. Omol/L的IPTG，37°C诱导表达2h 8h，诱导完毕后4°C、12000r/min离心收集菌体，反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理 10-15min,使菌体尽量全部破碎，超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀，之后4°C、12000r/ min离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用含8M尿素的PBS溶解，最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分；包涵体形式重组蛋白的纯化将挑选出的表达量高的重组菌200 μ L接种于20mL Kan/LB液体培养液中，37°C，230r/ min振荡培养10-12h ；取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中，37°C，于2L锥形瓶中于振荡培养约池至 OD600nm = 0. 6 0. 8 ；加入IPTG至终浓度为lmmol/L，37°C继续诱导培养他；细菌诱导培养物于4°C以3500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，将菌体用PBS 洗涤3次，每次以4°C，3500r/min离心20min，之后重悬于15mL的PBS缓冲液中，反复冻融3次，至菌体粘稠；·4°C冰浴中超声裂解菌体沉淀，待超声结束后于4°C，6000rpm/20min离心收集包涵体； 加入0.2 %用solutionA配制的DOC 30ml混勻，室温静置30min，4 °C, 9000-10000rpmX20min离心收集沉淀包涵体；用0. 2%的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpmX20min离心；用2 %的用solutionA配制DOC 30ml混勻包涵体，室温静置30min ； 40C 9000-10000rpmX20min离心收集沉淀包涵体；用 solutionA 配制 0. 9% 的 SKL,室温溶解包涵体 1. 5_2h ；4°C 7500rpmX20min 离心，收集上清；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：才学鹏，窦永喜，蒙学莲，毛立，李辉，骆学农，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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