一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株，该重组菌株是通过在宿主中表达来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因、来自枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因、来自大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶基因和二羟酸脱水酶基因、来自乳脂乳球菌的酮酸脱羧酶基因获得的重组菌株，利用该菌株可以直接将木薯淀粉转化生产异丁醇。
【技术实现步骤摘要】
利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应用
本专利技术属于生物工程
，特别是一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
异丁醇甲基丙醇)可用于生产石油添加剂、抗氧剂、油漆溶剂、增塑剂、合成橡胶、合成药物，也是工业上重要的高级溶剂，是生产涂料、清漆的重要配料。异丁醇具有易于生物降解，没有生物蓄积作用，不会直接毒害鱼类、两栖动物、甲壳类和藻类的特性。因此，异丁醇作为重要的工业原料，它的生产受到了重视。目前工业上大规模生产异丁醇是采用化学合成的方法。异丁醇是在用丙烯羰基合成生产丁 /辛醇工艺过程中产生的丙烯羰基合成反应，粗醛精制得到正丁醛和异丁醛，正丁醛和异丁醛加氢得到产品正丁醇和异丁醇，正丁醛经缩合、加氢得到产品辛醇。异丁醇其实是丁/辛醇生产过程的副产品。由于丙烯羰基合成醇的生产能力有限，随着化学品合成市场的转变，国际上主要丁 /辛醇生产商，如美国伊斯曼化学、陶氏化学、塞拉尼斯公司等纷纷宣布提价，使异丁醇价格进一步上涨。因此，寻找替代丙烯羰基化学合成方法生产异丁醇成为具有重要前途的工业技术。在微生物发酵生产醇类化合物中，乙醇是通过酵母发酵的方法生产，正丁醇是通过梭菌的ABE发酵的方法生产。而异丁醇不同于正丁醇，它的羟基在第二位碳原子上面，在梭菌的ABE发酵中不产生异丁醇。在自然界中也没有微生物天然大量产生异丁醇。因此，针对异丁醇生物发酵的问题，只有利用途径工程的方法改造微生物，以获得新型的发酵菌株来生产异丁醇。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株及其构建方法和应用，通过改造大肠杆菌的代谢途径，获得直接利用木薯淀粉发酵生产异丁醇的菌株，这个改造的菌株可以用于工业上以木薯为原料生产异丁醇。本专利技术通过以下技术方案达到上述目的一种利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株hcherichia coli gxas-AIKA, 该重组菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011281.一种质粒pSTM9-AIIK，它含有alsS、ilvC、ilvD和kdcA基因，这四个基因分别是来自枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因、来自大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶基因和二羟酸脱水酶基因、来自乳脂乳球菌的酮酸脱羧酶基因。一种质粒pSE380-AMY，它含有amy基因，这个基因是地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis的淀粉酶基因。质粒pSTV29-AIIK和pSE380_AMY共同在大肠杆菌菌株中表达。含有质粒pSTM9-AIIK和pSE380_AMY的大肠杆菌菌株gxas_AIKA在以木薯淀粉为唯一碳源的培养基上进行发酵生产异丁醇，具体方法为将gxas-AIKA菌株接种到发酵培养基中，在37°C、250r/min条件下培养，待长至0D_为0. 4-0. 6时加入终浓度lmmol/L的 IPTG，并继续培养M小时，得到含有异丁醇的发酵液，异丁醇含量为3克/升。本专利技术突出的实质性特点和显著进步是提供了一种直接发酵木薯淀粉生产异丁醇的方法。木薯淀粉不需预先加入淀粉酶进行糖化处理，可以直接被本专利技术所构建的菌株发酵生成异丁醇。附图说明图1是本专利技术所述重组菌株的发酵液异丁醇气相测定图。2. 801分钟为异丁醇，2. 872分钟为内标正丁醇。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的技术方案进一步描述。实施例1本专利技术所述利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株的构建方法，包括如下步骤1、质粒 pSTV29-AIIK 的构建1. 1基因扩增提取枯草芽孢杆菌的总DNA为模板，用上游引物 GCCTGCGCATGCCACAAAAGCAACAAAAGA,下游引物ACGCAGTCGACCTAGAGAGCTTTCG，PCR 扩增 alsS基因；提取大肠杆菌的总DNA为模板，用上游引物ACGCAGTCGACAGGAAACAGACCATGGCTA ACTACTTCAAT，下游引物CGGGATCCTTAACCCGCAACAGCAATAC，扩增 i 1 vC 基因，用上游引物CG GGATCCAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTC,下游弓丨物GCCGAGCTCTTAACCCCCCAGTTTCGATTTAT C，PCR扩增ilvD基因；提取乳脂乳球菌NIZO B1157的总DNA为模板，用上游引物GCGAGCT CAGGAAACAGCTATGTATACAGTAGGAG，下游引物GCCGAGCTCCTATTTATTTTGCTCAG，PCR 扩增 kdcA 基因。L2PCR扩增条件反应条件94°C2min，94°C 30s，54°C t1min,72°C t2min，30 个循环；72°C lOmin。引物 1-4 的退火时间 ti 和延伸时间 t2 分别是 53°C、1. 5min，58°C、l. 5min，62°C、2min，59°C、 1. 5min。1. 3PCR产物的酶切和连接先将Ml I、BamHI双酶切的iIvC片段、BamHIjacI双酶切的iIvD片段与用Mil、 SacI双酶切的pSTM9质粒，质粒购买自大连宝生物公司，进行三片段连接，构建表达质粒 pSTM9-ilvC-ilvD。再将SphI、Sail双酶切的alsS片段与用SphI、Sail双酶切的质粒 pSTV29-ilvC-ilvD进行连接，构建表达质粒pSTM9-alsS-ilvC-ilvD。最后将&icl酶切的kdcA片段与经Mel酶切的质粒pSTV29-alsS-ilVC-ilVD进行平端连接，构建表达载体 pSTV29-alsS-i1vC-i1vD-kdcA。2、质粒 pSE380-AMY 的构建2. 1淀粉酶基因AMY的扩增。提取地衣芽孢杆菌的总DNA作为模板，用上游引物5’-CGAGCCCATGGCTAAACAACAAA AACG-3，，含有 NcoI 酶切位点，和下游引物 5，-GTACCCATGGTCTGTTTCCTCTATCTTTGAACATAAAT TGAAACCG-3’，含有NcoI酶切位点，进行PCR扩增AMY基因。2.2PCR 扩增条件反应条件94°C3min，94°C 30s，48°C 30s，72°C 1. 5min，30 个循环；72°C IOmin02. 3PCR产物的酶切和连接将AMY片段用NcoI酶切，然后与用同样酶切的pSE380质粒连接。构建pSE380_AMY 质粒。3、质粒 pSTM9-AI IK 和 pSE380_AMY 的共表达制备大肠杆菌BW25113的CaCl2感受态细胞，先把质粒pSTM9_AIIK转化入 BW25113菌株。然后把含有pSTW9-AIIK质粒的BW25113菌株再制备成CaCl2感受态，把 PSE380-AMY质粒转化入，双质粒转化菌株gxas-ΑΙΚΑ保存在平板中。实施例2本实施例为本专利技术所述利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株的发酵实例。将含有pSTM9-AIIK和pSE380_AMY双质粒的重组菌株接种到LB培养基，所述LB 培养基成分及含量(g/L)为胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10。将过夜培养的种子液按5%接种量接种于发酵培养基中，于37°C温度下，250r/本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄日波，庞浩，林丽华，郭媛，陈燕，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：
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