一种含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统、其快速构建的方法及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统、其快速构建的方法及应用，包括以下步骤：S1，tracrRNA和crRNA设计成单个嵌合体gRNA，获得gRNA骨架；S2，所述gRNA骨架、第二Cas9蛋白和表达元件组装成CRISPR/Cas9系统的质粒；S3，增殖并提取质粒；S4，内切酶对S3中所述质粒的内切酶识别位点进行酶切，获得含有Cas9的大片段，其中，所述内切酶为IIS型限制性内切酶或同裂酶；S5，根据编辑位点设计能与gRNA骨架连接的片段，获得gRNA；S6，将所述含有Cas9的大片段与gRNA连接，获得含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统。本发明专利技术方法获得含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统，更方便、快速地获得编辑一个或多个位点的CRISPR/Cas9系统，用该系统可以快速对野生型工业酿酒酵母的一个位点或多个位点进行编辑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程，具体涉及含有打靶目标位点的crispr/cas9系统、其快速构建的方法及应用。

技术介绍

1、crispr/cas9系统是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。crispr/cas9系统对入侵核酸的沉默需要crrna(crispr-derivedrna)引导，分为3个步骤：(1)含有crispr基因座的宿主将入侵核酸的短序列(也称原间隔子)整合到宿主crispr阵列近端的染色体，被整合的短序列(也称间隔子)被相同的重复序列分隔开；(2)间隔子被转录成crrna前体(pre-crrna)，pre-crrna被酶切后形成含有间隔子的crrna；(3)crrna与cas形成复合物，引导cas沉默入侵核酸。目前crispr/cas9系统能同时编辑一个或多个基因，是基因组编辑的有力工具。

2、crispr/cas9系统由表达cas9蛋白的序列和表达grna的序列两个组分组成，其中构建crispr/cas9系统的关键步骤是grna的设计，设计的grna是否能特异性地发挥作用又是基因编辑成功与否本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种快速构建含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述快速构建含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述gRNA骨架、第二Cas9蛋白和表达元件组装成含有CRISPR/Cas9系统的质粒的具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述快速构建含有打靶目标位点的CRISPR/Cas9系统的方法，其特征在于，表达元件包括GAL1 promoter、SV40 NLS、CYC1terminator、2μori、AmpRpromoter、AmpR、pBR322 origi...

【技术特征摘要】

1.一种快速构建含有打靶目标位点的crispr/cas9系统的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述快速构建含有打靶目标位点的crispr/cas9系统的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述grna骨架、第二cas9蛋白和表达元件组装成含有crispr/cas9系统的质粒的具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述快速构建含有打靶目标位点的crispr/cas9系统的方法，其特征在于，表达元件包括gal1 promoter、sv40 nls、cyc1terminator、2μori、amprpromoter、ampr、pbr322 origin、snr52 promoter、sup4 terminator、kanr和tef terminator。

4.根据权利要求3所述快速构建含有打靶目标位点的crispr/cas9系统的方法，其特征在于，所述表达元件还包括表达指示标记的序列，所述表达指示标记的序列包括plac和mrfp1。

5.根据权利要求4所述快速构建含有打靶目标位点的crispr/cas9系统的方法，其特征在于，所述表达指示标记的序列相对两端连接内切酶识别位...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小玲，芦志龙，陈英，陆琦，陈东，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：