去除逆转录和扩增反应中的核酸污染的方法技术

本发明专利技术提供了从逆转录反应和热启动PCR去除核酸污染的方法，其中所述热启动PCR是隔离热启动PCR装置和/或涉及热启动DNA聚合酶，所述方法包括使用这样的DNase，该DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。本发明专利技术还提供了DNase、编码所述DNase的核酸和包含所述DNase或所述核酸的试剂盒或组合物，所述DNase在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过使用DNase从逆转录反应混合物、热启动DNA聚合酶制剂和热启动PCR反应混合物中去除污染DNA。本专利技术还涉及通过使用DNase来防止核酸扩增反应，尤其是涉及靶序列的逆转录、热启动DNA聚合酶和/或隔离热启动PCR装置的扩增反应中的假阳性结果。本专利技术还涉及适用于这些方法的极不耐热的DNase。
技术介绍
核酸扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)是可用于生物
中的最有力的工具之一，其允许由仅含有少量核酸的样品制备出大量拷贝的靶序列。就PCR而言，将与双链靶序列的各链互补的寡核苷酸引物添加到含有靶序列和游离核苷酸的反应混合物中。在 DNA聚合酶存在下的热循环导致引物间序列的扩增。由PCR过程所产生的扩增片段能用作随后PCR循环的模板的能力导致快速产生大量的靶序列。即使一个拷贝的靶序列也能够产生足以允许通过例如与标记探针杂交或将32P标记的脱氧核苷三磷酸掺入扩增节段检测的核酸连接酶扩增反应(LAR)也称为连接酶链式反应(LCR)，与PCR类似，其利用重复循环和交替温度来实现靶序列拷贝数的指数增加。在这种方法中，DNA连接酶催化与靶DNA链中的一条的邻近区互补的两段寡核苷酸的连接。与另一条链互补的另两段寡核苷酸也可以被连接。变性之后，最初的模板链和两段连接对可以用作下一轮杂交和连接的模板。链置换扩增(SDA)利用参与DNA切除DNA修复的酶的特性来用新合成的链替换 DNA双螺旋中的一条带缺口的DNA链。为了重复产生带缺口的单链，使用诸如Hindi或 BsoBI的限制性内切核酸酶，当DNA的互补链被半硫代磷酸化时，这些限制性内切核酸酶仅在其识别位点的一条链上使DNA产生缺口。本方法中所用的引物含有合适的识别位点，并且在聚合反应中使用dATP α S。基于核酸序列的扩增(NASBA)也称为3SR(自主序列复制)，本质上是天然逆转录病毒转录的体外形式。3SR涉及由RNA模板重复逆转录以形成cDNA模板。RNA聚合酶从 cDNA模板产生相应的RNA。环介导的等温扩增(LAMP；Notomi，T.等，Nuc. Acid Res. 2000 Vol 28(12)e63)是基于自动循环的链置换DNA合成的原则。具有高的链置换活性的DNA聚合酶(例如，Bst DNA聚合酶大片段)与特异设计的引物一起使用。该过程在不需要解链的情况下通过链分离来展现新的靶序列(因而该过程是等温的)。逆转录是这样的过程，在该过程中，单链RNA(ssRNA)模板被转录成互补的单链 DNA,然后，单链DNA可用来形成双链DNA (dsDNA)。一些酶能够产生第一 DNA链且能够合成第二链以形成dsDNA，而其它酶仅对两个步骤中的一个是特异的。然后，ssDNA和dsDNA可用于多种分子生物学应用中。例如，它们能直接用于基于探针的检测测定(例如Southern 印迹)、测序实验或克隆方案中。通常，cDNA在诸如PCR、LCR、SDA、LAMP或3SR的扩增反应中可被进一步扩增，从而例如为上述实验提供更多的物质或者能够定量初始样品中所存在的RNA模板的量。逆转录连接的扩增反应可以是“一步”法或“两步”法。在一步法中，逆转录反应和核酸扩增反应中的组分存在于一个反应容器中，并且通常选择早期反应条件以允许进行逆转录反应至完成，然后将反应条件转换成适于允许进行核酸扩增反应的条件。在两步法中，首先将逆转录反应的组分混合，并进行逆转录反应。然后将逆转录产物与扩增反应的组分混合，并进行扩增反应。在“一管”两步方案中，将扩增反应组分添加至进行逆转录反应的同一反应容器中。在“两管”两步方案中，在新的反应容器中进行扩增反应。在一步法或两步法中，逆转录可以与PCA、LAMP、LCR、SDA或BSR中的任一种联合。 就SDA而言，应选择热稳定的链置换酶和热稳定的限制性酶(例如BsoBl)。这些扩增技术扩增微量靶序列的能力使得它们对RNA靶序列(即按照或利用逆转录的那些扩增反应)情况下通过基因组DNA的污染和通过DNA分子中的靶序列来自之前的扩增反应的污染高度敏感，以上两种污染均可能残留在试剂(例如聚合酶、引物、反应缓冲液等)、移液装置、实验室表面、手套或气雾化中。通过搅动溶液如溢出过程中，或者甚至是通过搅动容器表面的少量的物质如塑料管盖的内表面上的残留物都能够产生气溶胶，当打开所述塑料管时残留物能够雾化。当为了医疗诊断或法医原因来研究样品核酸时，由通过偶然引入到可能包含靶序列的核酸(称为残留物)的反应混合物所导致的假阳性结果的影响可能是深远的。对核酸污染具有不利影响的特定灵敏度的扩增反应是定量PCR技术，因为这些技术有能力对反应中不到20拷贝的DNA序列进行定量。因此，即便是最低水平的核酸污染也可能在qPCR技术中产生假结果。此外，这些方法需要检测来自不可避免的背景信号之上的扩增靶核酸的信号。污染的核酸能提高该背景信号，并因此降低该技术的灵敏度。因此，将污染的核酸降至最低能使定量PCR实验的灵敏度最大化。在检测少量拷贝数的靶核酸的实验中，例如基于定量PCR的病原体诊断和病原体负荷定量实验，最重要的是使定量PCR的灵敏度最大化和假阳性最小化。在细菌鉴定和诊断领域，其中通过qPCR技术靶向于高度保守的细菌DNA节段(例如16SrRNA或23SrRNA基因)，来自DNA聚合酶制剂的核酸污染(通常获自细菌或细菌表达系统)是主要问题。因此需要从DNA聚合酶制剂有效去除细菌核酸污染物的方法。尤其寻求能实现这点，并且对下游扩增反应没有不利影响和不损坏聚合酶的方法。已经开发出多种用于防止或限制残留物影响的技术。就PCR而言，这些技术包括巢式引物，即与用来起始PCR的两种引物的退火边界内的靶序列退火的引物(K. B. Mullis 等，Cold Spring Harbour Symposia Vol. Li, pp 263-273,1986)。巢式引物的较短的 PCR 扩增产物不能与起始引物退火，所以如果是该产物被残留，那么使用起始引物就不会扩增该残留物。然而，并没有去除残留物，如果在随后的PCR中使用相同的巢式引物，则巢式引物之前扩增的产物会被扩增。已开发出的方法涉及将核苷酸脱氧尿苷三磷酸(dUTP)替代脱氧胸苷三磷酸 (dTTP)掺入逆转录的/扩增的核酸序列中。由于脱氧尿苷(dU)通常并非存在于天然存在的DNA中，因此该碱基能将之前产生的扩增子与新的靶序列区分开来。在另一逆转录/扩增反应开始之前，可以用尿嘧啶DNA转葡糖基酶(UNG)处理扩增反应混合物，该酶去除尿嘧啶碱基，保持糖-磷酸二酯骨架完整，并在单链(ss)和双链(ds)DNA中产生了脱碱基位点(US-A-5, 418，149)。提高扩增反应混合物的温度，以便在脱碱基位点处切割DNA，这会导致残留物的降解。该方法同样并非没有问题，因为将dUTP掺入逆转录/扩增产物能干扰随后的产物分析，例如通过限制性酶切割或PCR(聚合效率可被降低，并且排除了校正聚合酶的使用)。 同样，UNG应被不可逆地失活，否则来自随后逆转录/PCR反应的产物会被降解。提高温度是使UNG酶失活的常用方法，但是迄今很多商购的UNG酶即便在暴露于PCR反应的温度之后也不会被成功失活。为了使残余UNG活性的影响最小化，扩增反应中所用的温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫顿·艾尔得，欧拉乌·莱尼斯，达格·如尼·耶莱斯维克，
申请(专利权)人：生物科技医药公司，
类型：发明
国别省市：