用于抑制HIV进入的α体制造技术

本发明专利技术涉及被称为“α体”的HIV-1?gp41结合性单链3股α-螺旋式卷曲螺旋分子、编码所述α体的核酸、包含所述核酸的宿主细胞和包含所述α体的药物组合物，以及使用所述α体治疗、预防和诊断HIV感染的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)和HIV感染的治疗领域。更具体来说，本专利技术涉及新型HIV进入抑制剂。本专利技术还涉及使用被称为“α体”的单链3股α-螺旋式卷曲螺旋分子，用作靶向gp41子区域的HIV进入抑制剂。
技术介绍
HIV-I Env复合体，也称为“包膜糖蛋白复合体”或“gpl20/gp41复合体”或“HIV 刺突”，是用于治疗HIV感染的首要靶点。它们展示在HIV病毒粒子和被工程化改造以表达包膜刺突的细胞的表面上。HIV进入靶细胞和细胞-细胞融合主要由展示在表面上的Env 糖蛋白复合体的作用介导。通常认为，阻断病毒进入或细胞融合的能力对于HIV感染的治疗来说有很高价值。病毒进入的抑制可以通过特异性靶向gpl20、gp41或融合介导受体CD4、CCR5或 CXCR4的子区域的抗病毒化合物来实现。特异性靶向gp41的化合物例如恩夫韦地(Fuzeon， T-20)旨在通过阻断融合机制中的关键步骤来行使其抗病毒效果。该关键步骤通常被称为六螺旋束的形成。六螺旋束作为gp41-HRl片段形成三聚体平行卷曲螺旋结构以及HR2片段紧密结合在该卷曲螺旋上的结果而形成。因为HRl可以通过位于N-端的融合肽附着到靶细胞膜上，而HR2通过位于C-端的跨膜片段附着到病毒膜上，因此据信gp41链的胞外结构域缩聚成紧凑的六螺旋束使两个膜接近，促进了膜融合并因此促进病毒粒子(或其内含物)进入靶细胞。专利技术概述本专利技术涉及一类新的HIV进入抑制剂，其特异性针对(靶向)gp41中的子区域，用于阻断六螺旋束形成。这种新的抑制剂类型对应于被称为“α体”的单链卷曲螺旋蛋白支架，其被工程化改造以与gp41_HRl (或序列中的邻近片段)或gp41-HR2(或邻近片段)结合。本专利技术还涉及能够同时与gp41的HRl和HR2区域或邻近区域结合的双功能α体。此夕卜，本专利技术涉及使用这样的α体来抑制HIV Env介导的细胞-细胞融合、抑制HIV病毒进入、抑制病毒复制、在哺乳动物和人类细胞中治疗HIV感染，涉及使用α体治疗HIV感染个体的方法、筛选新的抗HIV化合物的方法、被称为竞争测定法的方法和对个体进行抗HIV免疫接种的方法。本专利技术涉及被称为“α体”的单链3股卷曲螺旋支架的应用，所述α体被工程化改造以便结合HIV gp41的子区域，例如gp41氨基酸链中的HR1、HR2和邻近子区域。预期与这些子区域的结合将阻断六螺旋束形成，因此也阻断HIV进入、细胞-细胞融合、病毒复制和哺乳动物和人类细胞的感染。在优选实施方案中，本专利技术的α体与单一 gp41子区域结合，而在另一个优选实施方案中，它同时与两个不同子区域结合(双功能、双特异性结合)。 提供了产生这类α体的实用实例。本专利技术还涉及用于在个体中抑制HIV感染的方法。此夕卜，提出了将本专利技术的α体作为有用的筛选工具，通过直接结合测定法或通过竞争测定法鉴定新的HIV抑制分子。最后，提出了将本专利技术的α体作为疫苗或药物给药的方法。附图简述附图说明图1、由HRl和HR2来源的肽构成的六螺旋束的形成。白色圆柱体表示形成三聚体平行卷曲螺旋(N-三聚体)的gp41-HRl来源的肽片段；灰色圆柱体表示与HRl-螺旋对之间的沟结合的gp41-HR2来源的肽片段。标记“N”和“C”分别表示螺旋的N-和C-末端。 因此，HR2螺旋以相对于HRl螺旋反平行取向结合。结合的结果是如白色箭头的右侧所示的六螺旋束。图2、由来自于gp41的HRl和HR2片段通过环区域互联而构成的六螺旋束的形成。 阴影和标记与图1中相同。弯曲箭头表示在六螺旋束形成之前(白色箭头的左侧)和六螺旋束形成之后(右侧)JfHIV Env刺突中的HRl片段(白色圆柱体)与HR2片段(灰色圆柱体)相连的环区域(二硫环、发夹环)。在天然或受体激活的刺突中HRl和HR2螺旋的相互取向不是必需与左图中所描绘的相同；后者旨在说明HRl和HR2片段是共价互联的并且在空间上仍然分离。图3、平行和反平行α体。图Α，平行α体；图B，反平行α体。平行的螺旋用白色圆柱体表示，而在图B中与另外两个螺旋反平行的螺旋被描绘成灰色圆柱体。将不同螺旋相连的弯曲尖头表示连接物片段。小的未连接箭头表示α体的N-和C-端延伸部分。螺旋按照它们在由单链氨基酸序列构成的α体中的出现顺序标记为A、B、C。图4、α体与gp41 HR2的结合。阴影和标记与图2和3中相同。α体用粗体圆柱体表示。该图显示，α体与gp41的HR2片段的结合阻止了后者与gp41 N-三聚体结合， 从而预先排除了六螺旋束的形成。图中没有显示HIV刺突中的两个或三个HR2片段被相等数量的α体结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图5、α体与gp41 HRl的结合。阴影和标记与图4中相同。该图显示，α体与 gp41 N-三聚体的结合阻止了后者与gp41 HR2片段结合，因此预先排除了六螺旋束的形成。 图中没有显示两个或三个α体与HIV刺突的相等数量的N-三聚体沟结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图6、α体与gp41 HRl和HR2的同时结合。阴影和标记与图4中相同。该图显示，α体与gp41 N-三聚体和gp41 HR2片段的同时结合阻止了后者与N-三聚体结合，从而预先排除了六螺旋束的形成。因此，该图显示了双功能α体。图中没有显示两个或三个 α体以相似方式与HIV刺突结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图7、与残基嫁接相关的结构特点。图A显示了 N-三聚体和HR2螺旋的示意图。在该实例中，N-三聚体取自发表在Root等，Science 2001,291 :884-888中的N40序列。HR2 序列取自C38序列(同上)。螺旋以N-三聚体的Z-轴指向后方(N-端在前)和HR2螺旋轴指向前方(N-端在后)的方向俯视。因此，被圈住的螺旋彼此反平行。圆圈之间的小箭头表明不考虑方向上的错配，HR2(C_)螺旋叠加在N-螺旋顶上。在实际情况中，这对应于将 HR2的c、f、b、e、a、d、g位分别作图在N_螺旋的d、a、e、b、f、c、g位上。用装配的C_螺旋代替N-螺旋将给出如图B中所描绘的类似构建物。然而，这种重组N-和C-肽片段的方式的直接和严重的问题是不可避免地扰乱核心包装。本专利技术的关键在于，当使用反平行α 体时不存在这样的问题。足以将图A中HR2的标记为d、a和e的位置分别嫁接到图B中标记为b、f和c的位置上，以获得具有良好包装的异亮氨酸核心，并显示出HR2结合性沟和带有沟结合性HR2残基的螺旋两者的α体构建物。图C和D说明了这样的构建物如何能够捕获病毒gp41分子中的相应区域；图C和D中的视图分别沿着和垂直于螺旋轴(所有螺旋都是理想化的并忽略了超螺旋)。双箭头表示非成键相互作用(结合)。连接来自病毒的N-螺旋和HR2螺旋的长箭头表示发夹环。图D清楚地显示了 α体(具有嫁接的HR2残基)中的螺旋B与来自病毒N-三聚体(形成结合位点)的一对螺旋是反平行的。同样地， α体的形成沟的螺旋A和C与病毒的HR2螺旋也是反平行的。因此，该图解释了构成具有同时靶向HIV-I Env刺突中的N-三聚体和HR2片段的能力的双特异性α体的构建基础的基本原理。图8、α体与HRl和HR2序列的序列比对。Α,被称为“Ν-40”的HRl序列(gpl6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·德斯麦特，伊格纳斯·拉斯特尔斯，索菲·凡维特斯温克尔，
申请(专利权)人：康普里斯有限公司，
类型：发明
国别省市：