抑制人铁调素的RNA、重组体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制人铁调素（Ｈｅｐｃｉｄｉｎ）表达的小干扰性ＲＮＡ。本发明专利技术进一步公开了编码所述小干扰性ＲＮＡ的相应ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ以及能表达所述ＲＮＡ的重组体。本发明专利技术的小干扰性ＲＮＡ、ＤＮＡ以及重组体能够有效抑制体内人铁调素表达，调节体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、生物医药及基因工程
，具体涉及利 用逆转录病毒(Retrovirus)介导的RNA干扰技术，构建针对人铁调素 (HEPCIDIN)基因的逆转录病毒干扰体系(Retro-FPN)，并将其运用到 铁代谢相关疾病的药物开发制备当中。
技术介绍
RNAi指的是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA 时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。RNA干扰过程主要有2个步骤(1)长双链RNA被细胞源性的双链 RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (2)小干扰性RNA与细胞源性的某些 酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的 mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。1998年，安德鲁'法厄(Andrew Z. Fire)等在秀丽隐杆线虫(C.elegans) 中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正链或 反链RNA显示出了更强的抑制效果(Fire et al., 1998)。从与靶mRNA的 摩尔比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制 效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有 某种酶活性参与其中。随后，又相继发现具有RNase III活性的Dicer可将 长的双链RNA加工成称之为siRNA (small interfering RNA)的21 23nt 及3'端突出的短的双链RNA，siRNA与若干个蛋白组成称之为RISC复合 物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白复合物，并由该复合物 主导RNAi效应。2001年，Tuschl等将短的siRNA导入到哺乳动物细胞 中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应， 由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于生物种 中，因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范 围已经超越了 PTGS (posttranscriptional gene silencing),如RNAi机制同 样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。2006年，安德鲁.法厄与克 雷格.梅洛(Craig C.Mdlo)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生 理及医学奖。由外界导入的长的双链RNA首先被称作Dicer并具有RNaseIII活性的 RNA酶切割成21 23碱基对的小的双链RNA，这种RNA被称作small interfering RNA(siRNA)，其特征是3'端相对于互补链突出两个碱基。完成 上述过程后，siRNA上结合RNAi蛋白因子，并形成称为RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白复合物。在RISC复合物中，siRNA 依赖于ATP/或ATP非依赖性的转换为单链，进而RISC被活化。活化型 RISC受己成单链的siRNA引导(guide strand),序列特异性地结合在标耙 mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。迄今为止已 鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇 (Drosophila melanogaster) RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AG02) 的因子，AG02蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AG02 是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切 割酶活性(slicer activity), RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴定为参与 RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫(C. elegans)的RNAi中必须的因子 有EGOl ，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存 在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的 dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成 新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在 人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基 本框架虽然相同，但存在着微妙差异。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和简单性，所以是基因功能研究 的重要工具。大多数药物属于靶标基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF) 方法更具优势。因此,RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重 要工具。同时，那些在耙标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以 被进一步开发成为RNAi药物。在药物靶标发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物 技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过 观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的 肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。 一旦所发现的基因属于可用药的靶标(如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外)， 就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外，被发现的靶标还可用 RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于 几种疾病治疗，如老年视黄斑退化。然而要将RNA干扰技术运用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表 达持续以及表达效率等重要问题。shRNA即短发夹RNA (short hairpin RNA)。在RNAi感染过程中，产 生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA 包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop 序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，从而降 解目的基因抑制其表达。人Hepc基因定位于19ql311,编码84个氨基酸的前体肽,含有3个外显子, 长约215Kb,成熟Hepc分子内有8个半胱氨酸残基,形成4个分子内二硫键，对 于维持分子的稳定性发挥重要作用。目前发现三种成熟Hepc肽,分别为 Hepc25、 Hepc22和Hepc20, Hepc25存在于人血液和尿中，尿中HepcK和 Hepc20肽较Hepc25N端少3个或5个氨基酸残基,可能是Hepc25的降解产物。 人体存在着严格的铁代谢调节机制，确保体内铁始终处于正常水平。在 人体，小肠是铁吸收的唯一部位，肝脏和网状内皮系统(reticuloendothelial system, RE)是铁储存的主要部位，而骨髓是利用铁的主要部位。机体铁 稳态(ironhomeostasis本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制人铁调素（ＨＥＰＣＩＤＩＮ）表达的ＲＮＡ，其特征在于：所述ＲＮＡ含有以下序列：　Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ．１：５’－ＣＡＧＡＡＣＡＵＡＧＧＵＣＵＵＧＧＡＡ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱忠明，葛啸虎，柯亚，
申请(专利权)人：香港理工大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]