本发明专利技术属于基因工程和基因诊断领域，提供了一种检测BANK1基因单核苷酸多态性的方法：首先，设计扩增rs10516487或者rs17266594位点的引物和探针；然后，以样本DNA为模板，利用上述引物和探针进行PCR扩增；引物中的上游引物和下游引物浓度不同，一种不小于另一种的浓度的5倍；最后，加入饱和染料，分析熔解度曲线，确定单核苷酸多态性。该方法可以检测外周血或体液中BANK1基因rs10516487和rs17266594的多态性，以判断罹患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬皮病等自身免疫性疾病的可能性。该方法快速、简单、无污染，检测结果分辨率高。本发明专利技术还提供了相应的检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和基因诊断领域，涉及BANK 1基因rsl0516487和 rsl7266594位点单核苷酸多态性(SNP)的检测及用途。
技术介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，患者体内存在多种自身抗体。该病多发于女性，对人体的皮肤、肺部、血管和神经系统都可造成伤害。资料显示，若有SLE家族史，则SLE的发病率为一般人的数十倍。SLE也与人种、民族有关。如美国黑人女性的发病率远低于欧美一般人群，而在中国，SLE的发病率却比欧美国家高。可见这种疾病与遗传以及环境有关。目前认为可能由遗传、激素与环境等因素综合作用引起机体免疫调节功能紊乱、抗原抗体和补体复合物沉积导致局部或全身组织或器官损害。SLE患者常伴有显著的T、B淋巴细胞异常活化。B淋巴细胞作为经典的免疫效应细胞在SLE自身免疫过程中发挥了重要的作用。B细胞支架蛋白上的锚蛋白重复序列1，简称BANK 1 (B-cell scaffold protein with ankyrin repeats 1)。支架蛋白是一种在调节信号传导中起着重要作用的蛋白质，它通过辅助蛋白激酶和磷酸酶与他们各自的底物结合而起作用。锚蛋白重复序列(ANK)是生物体中广泛利用的一种序列模体。ANK结构域介导蛋白质与蛋白质的相互作用，它能够和多种配体结合，从而实现纷繁复杂的生物功能。BANK 1基因编码的B细胞特异性支架蛋白， 在B细胞受体诱导胞内钙离子动员中起着重要作用。同时也可促进Lyn (—种主要在造血细胞中表达的膜结合蛋白酪氨酸激酶)介导的1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)发生酪氨酸磷酸化。IP3R是一种化学门控的钙释放通道。钙离子通过IP3R通道从内质网释放入胞浆。 IP3R被激活后可导致内质网或肌质网中Ca2+释放和胞质中Ca2+浓度升高。随后通过NFAT 等多条信号途径使B细胞抗原受体信号通路活化，导致B细胞免疫耐受的丧失，引起B细胞反应性异常增高。2008年Kozyrev等首次发表了关于BANK 1与SLE易感性的报道。他们的研究发现，BANK 1是SLE的易感基因，而且BANK 1上的两个SNP位点，rsl0516487和rsl7^6594 与SLE的发病关系密切。Chang等对中国香港地区人群的调查也证实了这一发现。rsl0516487位于连结IP3R的关键区域，是一个非同义替代的SNP位点。同义替代仅改变密码子但不改变所翻译蛋白质的氨基酸序列，一般认为它不影响蛋白质结构和功能。而非同义替代的密码子变异可导致所编码氨基酸的改变，从而影响蛋白质的生理功能。这种变异常常是导致生物性状改变的直接原因。rsl0516487的第61位氨基酸就是由精氨酸变为组氨酸。研究发现，BANKl存在一长一短两种亚型。短的亚型名为Δ 2亚型，意指BANKl 基因2号外显子全部缺失，导致其翻译生成的蛋白质缺少了 IP3R结合区域。rsl7266594 恰好位于该序列分支点上(图1)，其T等位基因的纯合子具有非常典型的分支点顺序 (YNYTGAYYN) (Y 嘧啶，N表示任何核苷酸)。分支点顺序是位于核mRNA内含子和II类内含子3’端附近的保守序列。内含子的序列分支点、内含子的5’-端剪接点(供位)以及3’-端剪接点(受位)是mRNA前体正确剪接所必需的。因此，rsl7266594的多态性直接关系到BANK 1基因Δ 2亚型的剪接效率。rsl0516487和rsl7^6594的多态性可能会影响到BANK 1基因的功能，从而通过一系列反应促使B细胞受体持续释放信号，导致B细胞过度活化。目前，筛查已知SNP常用检测方法有限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异寡核苷酸片段分析(AS0)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、 Taqman探针法、基因芯片、测序等多种技术。但各有缺点，如RFLP仅能检测有酶切位点的 SNP，无酶切位点不能检测；RFLP、SSCP, ASO、DGGE都要用到电泳方法，灵敏度有限，对环境有污染；Taqman探针法价格昂贵；基因芯片不适宜多样本、少数SNP位点的检测；测序虽然是核苷酸检测的金标准，但成本较高，周期长，不适合大样本的疾病关联分析。采用高分辨率熔解法(High-resolution melting，HRM)检测SNP是近年来新推出的一种方法。它根据熔解温度(Tm)判断产物的性质。熔解温度由PCR产物的GC含量、长度、序列和杂合情况决定。结合了新型的饱和染料(如SYTO 9)和具有高分辨率的PCR仪(如 Rotor-Gene 6000)，即使只有一个碱基的改变，也可以从熔解温度上体现出来。只需一种染料就可以满足任何目的基因的检测。但是如果在一个样本中同时存在多个突变，仅靠以上方法是不能判断的。或者当DNA样本纯度不高，PCR扩增出现引物二聚体时，会改变HRM 检测到的熔解温度，从而影响结果的判断。因此，Taqman探针法虽然价格较贵，且受到每个荧光探针仅能针对一个检测靶位等多种限制，却依然广泛被临床采用tt]。对于大规模样本的检测，为了降低成本，迫切需要一种同时结合了探针的特异性和染料的普遍性的分析方法° 未标记探针高分辨率熔角军法(unlabeled probe high resolution melting, unlabeled probe HRM)完全符合了这些要求。未标记探针法在PCR的基础上作了进一步改进3’端封闭的未标记探针、染料以及一对浓度不一致的引物。STOR Green I作为一种经典的染料在PCR中已经沿用了十几年。不过由于这是一种不饱和染料，不能完全填满DNA双链的小沟，在DNA解链的过程中游离下来的STOR Green I会重新结合到未解链的双链中，造成结果失真。过量的STOR Green I还会抑制PCR扩增。在未标记探针法中，适合PCR扩增的STOR Green I浓度仅能检测到熔解温度较高的产物，无法判断异源双链的存在。参考文献1.Kozyrev SV, Abelson AK, Wojcik J, et al. Functional variants in the B-cell gene BANKl are associated with systemic lupus erythematosus. Nat genet, 2008, 40: 211-216.2.Chang YK, Yang W, Zhao M, et al. Association of BANKl and TNFSF4 with systemic lupus erythematosus in Hong Kong Chinese. Genes Immun, 2009, 10: 414-420.3.Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics, 2007, 8: 597-608.4.Erali M, Palais R, Wittwer C. SNP genoty本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹和建，关明，张心菊，吴之源，陈宇明，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：
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