揭示了一种筛选胰岛素分泌加强剂的新方法以及进行该筛选的工具该工具包括编码荧光标记的Epac2的DNA，包含编码发出波长彼此不同的荧光的两种不同荧光蛋白的两种不同DNA和编码Epac2的DNA，这些DNA同框融合，和转化该DNA的细胞。还揭示了筛选胰岛素分泌增强剂的方法，该方法包括将一种候选化合物与转化有所述DNA的细胞接触，并检测该化合物是否结合Epac2。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，且更具体地涉及荧光标记的Epac2基因、该基因转化的细胞和利用此类细胞。
技术介绍
硫酰脲类(下文称作“SU剂”)广泛用作糖尿病治疗剂，己知其通过结合SU受体 (SURl)显示其效果，所述SU受体是ATP敏感性K+通道(Katp通道)的组分和调节亚基(非专利文件1-3)。Katp通道存在于胰腺β细胞的细胞膜上并通过其打开和关闭调节待分泌的胰岛素量。SU剂对所述SU受体的结合诱导胰腺β细胞表面的Katp通道关闭，这引发了细胞膜的去极化。这随之引起电压依赖性Ca2+通道打开以允许Ca2+流入细胞，从而增强胰岛素分泌。SU剂的例子包括甲苯磺丁脲，格列本脲，氯磺丙脲，格列齐特等。多种细胞内信号参与调节胰岛素分泌机制。具体地，细胞内产生的cAMP作为非常重要的信号分子行使调节胰岛素分泌细胞的功能。已知在通过cAMP引起的胰岛素分泌的调控机制内有两类通路，为蛋白激酶A依赖性通路和独立性通路。在蛋白激酶A独立性通路中，由Epac 2介导的通路是已知的(通过cAMP直接激活交换蛋白由cAMP激活的小G蛋白Rapl的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF))(非专利文献4-6)。cAMP直接结合激活的Epac2 有Rapl鸟嘌呤核苷酸交换活性，该活性激活Rapl，从而促进胰岛素分泌。如上所述，虽然有多种调节胰岛素分泌的机制，但对糖尿病治疗剂(包括SU剂) 的作用机制尚未完全阐明。Epac2有一个与其结构相似的同种型(Epacl)(非专利文献7)。Epacl有cAMP结合结构域，蓬乱蛋白(Dishevelled)，Egl_10，普列克底物蛋白(DEP)结构域(该结构域起着Epacl膜定位的作用)，Ras交换基序(REM)，和位于羧基末端的GEF结构域。除具有上述结构域外，与Epacl结构相似的Epac2还具有位于其氨基端的第二 cAMP结合结构域和与 Ras相互作用的Ras相关(RA)结构域。Epacl和Epac2都通过cAMP参与胞内信号传输。为了监测细胞内的通过cAMP的信号传输，已开发了作为荧光共振能量转移 (FRET)传感器的融合蛋白，该蛋白监测Epacl在活细胞内的活化，在所述蛋白内部分或全长Epacl夹在发出不同颜色荧光的两种其他蛋白之间，即青色和黄色荧光蛋白(非专利文献 8-10)。“FRET”是这么一种现象，当彼此接近的两种(供体)染料分子之一，如荧光蛋白， 被有一定波长的光(激发光)辐照以激发该染料分子时，激发能量通过电子之间的共振被转移到接近的另一个染料分子(受体)上。根据这一现象，通过由供体吸收的光能，所述受体发出一定波长的光(荧光)。因此，所述FRET技术是一种检测由FRET引发的荧光变化的方法。当用青色荧光蛋白(发出波长较短的荧光)的激发光(波长约440nm)照射由青色和黄色荧光蛋白和夹在它们之间的部分或全长Epacl (荧光标记Epacl)组成的融合蛋白时，该蛋白被激发，并利用部分所述激发能量发生FRET，黄色荧光蛋白也被激发并发出波长为535nm的荧光。另一方面，所述青色荧光蛋白的部分激发能量不引发FRET，但该青色荧光蛋白发出波长为480nm的荧光。因此，由所述荧光标记的Epacl发出的两种不同波长的荧光的强度比率(535nm波长的荧光强度/480nm波长的荧光强度)取决于该分子内青色和黄色荧光蛋白的构象和之间的距离。因此，当由于一些修饰或与别的分子结合导致上述分子构象变化时，所述比例也发生相应的变化。由于荧光标记的Epacl的高级结构发生变化(如当cAMP结合该分子时)，通过FRET技术对该变化的检测能够检测cAMP分子是否与Epacl 结合。因此，当用波长440nm的光照射荧光标记的Epacl时，通过检测利用FRET技术发出的荧光强度的变化，可以检测通过Epacl的信号传输是否存在。虽然如上所述已知在FRET技术中用Epacl作为传感器(FRET传感器)来测量信号传输的方法，但尚不知利用全长Epac2作为FRET传感器的方法。已知Epac2通过cAMP依赖性、蛋白激酶A(PKA)独立性通路介导胰岛素分泌(非专利文件11和12)。Epac2最初鉴定为与SURl (Katp通道的调节亚基)相互作用的分子 (cAMP-GEF II)(非专利文献 13)。已知SURl是SU剂的靶分子。SU剂和SURl的结合一方面引起Katp通道关闭，另一方面使电压依赖性Ca2+通道打开，并且这就通过使Ca2+内流入β细胞来增加胰岛素分泌 (非专利文件2)。对缺乏Kir6. 2基因(Katp通道亚基)的小鼠和缺乏SURl基因的小鼠的研究证明所述Katp通道的关闭是SU剂提高胰岛素分泌的先决条件(非专利文件14-16)。因此认为SU剂是通过Katp通道表现出作为糖尿病治疗药物的药理学作用。最近，Kir6. 2或SURl中的突变已证实会导致新生儿糖尿病和由Katp通道功能受损引起的各种症状(非专利文献17)。当胰岛素注射改为口服高剂量SU剂时，发现许多此类患者的血糖控制得到改善(非专利文献18)。此外，有临床报告称在SU剂中，格列齐特对患有新生儿糖尿病的患者没有效果， 而格列本脲改善此类患者的血糖控制(非专利文件19)。这一发现表明SU剂的作用机制并不统一。因此，了解SU剂的作用机制为新生儿糖尿病患者提供适当的治疗是很关键的。此外，澄清未知的作用机制是重要的，因为它会为开发具有不同背景因素的糖尿病患者的医学治疗新途径以及开发此类治疗的新疗剂提供线索和方法。引用文献列表非专利文献NPL 1 =Seino S.，(1999) Annu. Rev. Physiol. 61,337-62NPL 2 =Henquin J. C.，(2000)Diabetes 49，1751-60NPL 3 =Proks P.等，(2002)Diabetes 51，S368-76NPL 4 :de Rooji J.等，(1998)Nature 396,474-7NPL 5 =Kawasaki H.等，(1998) Science 282，2275-9NPL 6 :de Rooji J.等，(2000) J. Biol. Chem. 275, 20829-36NPL 7 :Bos J. L.等，(2003)Mol. Cell. Biol. 4，733-8NPL 8 =Nikolaev V. 0.等，(2004) J. Biol. Chem. 279,37215-8NPL 9 =Dipilato L. M.等，(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101，16513-8NPL 10 =Ponsioen B.等，(2004)EMBO R印.5，1176-80NPL 11 =Holz G. G.等，(2004)Diabetes 53,5-13NPL 12 =Seino S.等，(2005)Physiol. Rev. 85,1303-42NPL 13 =Ozaki N.等，(2000)Nat. Cell. Biol. 2,805-811NPL 14 =Miki T.等，(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,10402-6NPL 15 =Seghers V.等，(2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：清野进，张长亮，加藤惠，柴崎忠雄，
申请(专利权)人：国立大学法人神户大学，日本化学研究株式会社，
类型：发明
国别省市：
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