扩增富含GC的DNA模板的方法技术

提供了用于提高DNA聚合酶在富含GC的模板上的持续合成能力的方法。该方法涉及提供增强剂和有偏比率的dNTP，并且可以在DNA扩增反应中使用。该方法可用于检测与富含GC的重复有关的基因型，包括脆性X综合征。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】扩增富含GC的DNA模板的方法本专利技术在DNA合成的领域中，具体地涉及牵涉富含GC的模板和产物的合成。从第一次分离DNA聚合酶并确定可以在体外合成DNA的条件起，DNA合成反应已经广泛用于生物技术、医学、和研究应用中的制备和分析目的。聚合酶链式反应或PCR是一类可以快速且指数性扩增DNA序列的DNA合成反应。与其它循环的合成反应一样，它牵涉以循环方式重复复制目标序列。PCR的典型的执行牵涉提供与期望的序列的末端互补的引物、合适的缓冲液、镁盐、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、和嗜热性DNA聚合酶。将在例如基因组 DNA样品内含有的模板或目标DNA暴露于水溶液中的这些组分。经由不同温度的步骤来使混合物循环，所述温度促进模板的变性、引物与模板的退火、然后通过聚合酶延伸引物，产生更多的产物。因为每轮循环的产物可用作后续反应中的模板，产物的量大致以指数增加， 直至耗尽其它反应组分(最初过量存在)。参见例如美国专利4，683，202 ；M. J. McPherson 和 S. G. Moller, PCR :The Basics (第 2 版，Taylor 和 Francis) (2006)。PCR及循环核酸合成反应的其它形式是在分子生物学、生物技术中以及日益在医学中的一项标准工具。PCR及相关技术的关键优点是快速、低成本、灵敏性、对高通量分析的适应性、和通用性。扩增仅需要几小时或更少，小的个别反应可能花费价值完全不到1美元的试剂，所需要的模板量通常在毫微克范围中，自动化可以导致每台自动仪器每天运行数千次反应，并且引物可以设计为扩增几乎任何序列。对分析和制备应用两者广泛采用PCR及相关技术。PCR的典型制备应用是扩增序列，使得它可以在异源载体中克隆。此应用的特殊化变型是诱变PCR，其中有意降低反应的保真性以生成含有突变的目标序列的拷贝。然后，可以在下游研究或实验中使用克隆的突变体拷贝。诱变PCR可以通过使用有偏向的dNTP集合来实现，其中dATP、dCTP、 dGTP、和dTTP不以等摩尔比率存在。这可以提高PCR循环的延伸步骤期间掺入错配的频率，产生突变体产物。参见例如PCR Methods增刊2 :28-33(1992) ；Anal Biochem 224 347-353(1995)。虽然已经在上文所描述的有意地易错PCR中使用不平衡的dNTP集合，但是此类不平衡的诱变效果在其它应用中得不到赞同。诱变一般在分析应用中以及在突变体产物不是目标的制备应用中是不利的。实际上，突变体产物一般不合需要已经激发通过修饰聚合酶或其它反应组分来表征和提高反应诸如PCR的保真性的努力。参见例如Nucleic Acids Research, 24 :3546-3551 (1996)；美国专利 7，030，220 ；美国专利 6，881，559。此外，预期与不平衡的dNTP集合有关的错误率增加会限制反应产率，这是因为错配降低DNA聚合酶的持续合成能力(processivity)和掺入率两者。PCR的显著的分析应用是在诊断疾病或确定涉及具有大小多态性的遗传基因座的基因型。展现出医学相关大小多态性的基因座的例子是X染色体上的人FMRl基因的5’非翻译区(UTR)。正常的个体在此区域中通常具有5-44个CGG重复。相反，含有200至2000 或更多个CGG重复的此基因座的等位基因指示脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS) 0 此类等位基因称为全突变等位基因。这些等位基因是遗传不稳定的。患有FXS的个体可以4具有诸如共济失调、卵巢功能早衰、学习无能、和其它认知/行为状况(包括孤独症样症状) 等综合征的多种组合。PCR通用性的一个不幸例外是，难以长期扩增高度富含GC的序列，包括FMRl 5’UTR的全突变等位基因。优化FMRl PCR的尝试已经包括对常规的PCR测定条件的修饰。参见 Genome Res. 1996 年 7 月；6 (7) :633-8 ；Nucleic Acids Res. 1997 年 10 月 1 日；25 (19) 3957-8 J. Mol. Diagn. 2006 年 11 月 1 日 8 :544-550 ；Am J Med Genet. 1994 年 7 月 15 日； 51(4) :527-34。然而，FMRl PCR测定法开发超过15年后，近至2008年(Genet Med. 2008 年10月；10(10) :714-9)，一项检测新生儿中的脆性X的发表的试验性筛选研究报告了，“测定女性中的FMRl重复数目的内部确认方法中使用的定量聚合酶链式反应(PCR)分析的两种方法...不能产生可靠的且可再现的结果，，，以及此外“来自第一或二级分离物的第二次 失败高度提示了异常的FMRl CGG重复大小”(添加的重点)。如此，本领域技术人员仍将全突变脆性X等位基因的可再现PCR扩增视为未解决的问题。据报道，用PCR能精确评估的三联体重复的长度最多为约100个CGG重复，远低于全突变等位基因(Full Mutation alleles)的大小。此外，自约100个重复开始，对任何条带的检测变得越来越模糊。J Mol Diagn 7:605-12 2005)。此项困难，与FXS综合征的异质性质一起，导致应用诸如Southern印迹等方法来检测全突变等位基因。同前。Southern 印迹比PCR更费时且昂贵，而且很不适应于高通量执行。本专利技术部分基于令人惊讶的发现，即提供有偏向的dNTP集合，导致在DNA聚合酶对富含GC之模板的持续合成能力方面，比本领域已知方法有显著改善。在一些实施方案中，本申请提供了提高一种或多种DNA聚合酶在至少一种富含GC 的DNA模板上的持续合成能力的方法，该方法包括在包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液中进行DNA扩增反应。在其它实施方案中，本申请提供了包括通过在水溶液中进行PCR，来扩增富含GC 的模板的方法，所述水溶液包含(a)GC/AT比率2-10且总浓度0. 7-0. 9mM的dNTP ； (b)至少一种增强剂，选自甜菜碱、DMS0、和TWEEN-20 ；和(c)总浓度1. 5_2mM的镁；其中至少一种富含GC的模板包含FMRl的5’ UTR的CGG重复。而在其它实施方案中，本申请提供了检测与富含GC型三核苷酸重复病症诸如脆性X综合征、脆性X相关震颤共济失调综合征(Fragile X-associated tremor ataxia syndrome)、和/或脆性X相关原发性卵巢功能不全(Fragile X-associated primary ovarian insufficiency)有关的基因型的方法，包括对至少一种与富含GC的DNA模板进行DNA扩增反应，其中通过提供包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液来提高一种或多种 DNA聚合酶的持续合成能力。附图简述附图说明图1是经STOR-金染色的凝胶的照片。第4道和第四道是大小标志物，所选条带的大小在第四道的右侧标示。所有PCR反应使用含有多个等位基因的多个模板的混合物， 它们在FMRl 5’ UTR中有20、28-29、118、198、和约330个CGG重复。第1道-第3道和第 5道-第观本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：GJ拉萨姆，
申请(专利权)人：奥斯瑞根公司，
类型：发明
国别省市：