本公开涉及通过利用一组至少其中之一包含CGG重复区的一部分的引物扩增一组产物并分离所述产物产生产物大小和丰度的表现形式，从而确定三核苷酸(例如CGG)重复区内是否存在AGG或中断元件及其位置的方法，和确定该区域内存在的重复数目的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于DNA合成与分析领域，特别是涉及富含GC的模板和产物。MM自从首次分离到DNA合成酶并确定了体外合成DNA的条件，DNA合成反应已被广泛在生物技术、医药和研究应用中用于制备和分析目的。聚合酶链式反应，或PCR是可以快速和指数性扩增DNA序列的一类DNA合成反应。与其他循环进行的合成反应一样，PCR涉及以循环的方式反复拷贝靶序列。典型的PCR实施过程包括提供与待扩增序列末端互补的引物、合适的缓冲液、镁盐、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和嗜热DNA聚合酶。包含在例如基因组DNA样品中的模板或靶DNA与这些成分在水溶液中接触。混合物在不同温度进行循环，这些温度促进模板的变性、引物与模板的退火、然后聚合酶对引物的延伸，从而产生更多产物。由于每个循环的产物可以在随后的反应中作为模板，产物的量几乎指数增长直至其他反应成分(开始过量存在)被耗尽。参见例如美国专利4，683，202 ；M. J. McPherson & S. G. Moller, PCR :The Basics (2nd Ed.，Taylor & Francis) (2006)。PCR与其他形式的循环进行的核酸合成反应对于分子生物学、生物技术、以及日渐地对于医学都是标准工具。PCR和相关技术的关键优势是快速、低成本、敏感度、可用于高通量分析以及多能性。扩增只需要几小时甚至更短时间、少数的个别反应可能只耗费1美元以下的试剂、需要的模板量通常在纳克级别、自动化使得每个机器人每天可以进行几千个反应，可以设计出用于扩增几乎任何序列的引物。PCR及相关技术被广泛用于分析和制备应用。PCR的典型制备用途是用于扩增序列使它可以克隆到异源载体中。PCR重要的分析应用包括涉及具有大小多态性的基因座的病情诊断或基因型确定。表现出医学相关的大小多态性的基因座一个例子是，位于人X染色体上的FMRl基因的5’非翻译区(UTR)。正常个体的该区域内通常有5-44个CGG重复。相反，含有200到 2000或更多个CGG重复的基因座等位基因指示着脆性X染色体综合征(FXQ。这种等位基因被称为全突变等位基因(Full Mutation alleles) 0它们在遗传学上不稳定。患有FXS 的个体可能有诸如共济失调、卵巢早衰、学习障碍和其他认知/行为状况(包括类自闭症症状)的症状的各种组合。PCR多能性的一个令人遗憾的例外是难以扩增富含GC序列的长片段，包括 FMRl5' UTR的全突变等位基因。对FMRl PCR进行的优化企图包括对常规PCR方法条件的改进。参见 Genome Res. 6(7) :633-8(1996) ；Nucleic Acids Res. 25(19) :3957-8(1997)； J. Mol. Diagn 8 :544-550 (2006) ；Am. J. Med. Genet. 51 (4) :527-34 (1994)。但是在 FMRl PCR方法发展了 15年多以后，即使最近的2008年(Genet. Med. 10(10) :714-9 (2008))，一篇发表的关于检测新生儿中脆性X染色体的试验性筛选研究仍报道说“在确定女性中FMRl重复数目的内部验证过程中使用的...两种定量链式聚合酶反应(PCR)分析方法未能产生可靠和可重复的结果(粗体是后加的)，此外“由初级或次级分离物进行的二次PCR的失败高度提示FMRl CGG重复的异常大小”。因此，本领域技术人员仍然把可重复地PCR扩增全突变脆性X染色体等位基因看作是有待解决的问题。在通过PCR检测含有超过100个重复的CGG三联重复区时观察到，随着重复数目的增加，检测越来越弱(J. Mol. Diagn. 7 :605-12 (2005))。这一困难，结合FXS综合征的各不相同的特性，导致为了检测全突变等位基因使用诸如Southern印迹的程序(同上)。 Southern印迹通常比PCR更耗时，成本更高，没有PCR适合用于高通量应用。Tassone 等(J. Mol. Diagn. 10 :43-49 Q008) ；"Tassone 2008”)最近发表的文章描述了用于不经等位基因的全长扩增来检测较长CGG等位基因的分析法。还可参见 W02008/011170。该方法利用了与延展的CGG区内的位点杂交的嵌合PCR引物，这样如果存在宽的PCR产物弥散带就表明延展等位基因阳性(同上46页)。随机杂交策略可能导致非特异性扩增和分辨力不足。这篇文章中使用的基础PCR 条件已被多个不同实验室进行了检验，似乎可以成功扩增的CGG重复数目是大约350 CGG 重复。参见例如 Saluto et al. , J. Mol. Diagn. 7 :605-612 (2005) Tassone 2008 中的非特异扩增很明显。Tassone 2008附图说明图1所示的琼脂糖凝胶中的弥散带似乎含有的产物超过了包含350个重复的扩增子的预期最大长度，因此可能弥散带大部分不代表CGG重复的特异产物(参见Tassone 2008的图1 ；泳道5中的弥散带似乎延伸到上样孔内的空间)。Tassone 等在图3的图标中指出他们使用了 High-Low ladder (Bionexus, Oakland, CA)作为分子量标记，图1中的标记似乎与图3的相同。High-Low ladder中最大的条带大约101Λ，而图1 中的弥散带超过了该条带。这一长度也比分析中使用的样品的预期全长产物长。列出的最大等位基因大小是615个CGG重复。因此，通过给1845nt重复加上大约200nt旁侧序列估计出全长产物预期大约21Λ。非特异性产物会降低基于扩增的脆性X染色体关联等位基因状态的确定方法的准确性和可信度。此外，用于检测脆性X染色体的一些单纯基于基因特异性引物设计的常规PCR方法有局限性。例如，这类方法根据PCR扩增子的迁移率提供对CGG重复数目的一个估计。为了能够准确地确定重复数目，通常相对外部校准物(例如一组合适的分子量标准)来测量扩增子迁移率。能够不依赖外部校准物的情况下准确确定CGG的数目将是可取的。而且，FMRl等位基因可能含有散布在CGG重复中的AGG序列，通常位于重复区段的 5’区域。对AGG序列元件的了解可以从一方面表征等位基因。AGG序列元件可以用于临床决策。例如注意到某个仅含有59个重复的FMRl等位基因，从母亲到她的孩子中延展为全突变等位基因的病例，并且已知该等位基因缺乏任何AGG元件。参见Nolin et al. ,Am. J. Hum. Genet. 72 =454-464(2003)。的确，全突变如果会，也是很少在第一批20个CGG重复之后含有AGG元件，生物物理研究表明在CGG重复区段中带有AGG “中断者”的模板更可能采取更常规的DNA结构，更稳定和易于被准确地复制。参见例如Wfeisman-Shomer et al.，Nucleic Acids Res. 28 :1535-41(2000) ；Zhong et al. , Am. J. Med.Genet. 64 :261-5(1996) ；Larsen et al. , Am. J. Med. Genet. 93本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：GJ拉萨姆，陈良进，S萨，
申请(专利权)人：奥斯瑞根公司，
类型：发明
国别省市：
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