一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法。该方法包括下列步骤：对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；培养植物组织细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响。该方法能够快速鉴定uORF对翻译水平影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及。
技术介绍
真核生物mRNA 5'转录起始点和开放性阅读框(open reading frame, 0RF)的起始密码子ATG之间的核苷酸序列被称作5'非编码区。mRNA5'非编码区中存在的上游开放性阅读框(upstream open reading frame, uORF)在基因的翻译水平上的调控具有重要作用，一些uORF对下游开放性阅读框有抑制调控作用，而有一部分uORF则控制着mRNA的稳定性[1]。尽管测序表明，许多真核生物序列中存在uORF对下游开放性阅读框翻译的影响研究，但局限于少部分基因。体内和离体实验表明uORF参与细胞生长调控，特别是通过细胞翻译能力的调控，一部分uORF能抑制ORF的翻译，也有一些对ORF影响不大，相反，有一些uORF能促进ORF翻译。序列中这些uORF对翻译水平影响的研究，对我们了解翻译水平的基因表达调控具有重要意义。Imai等发现[2]拟南芥acl5基因缺失的转基因植物表现出植株矮小的症状，而且SAC51基因的uORF若提前终止翻译，则会引起下游开放性阅读框的翻译水平上升。Wiese等[3]研究发现在拟南芥AtbZIPll基因存在蔗糖引起的翻译抑制(SIRT)特性，且它的抑制翻译调控 依赖于5'未翻译区域。42个氨基酸编码的一个uORF片段控制了下游主开放性阅读框的翻译作用，从而导致细胞内蔗糖浓度的变化以应对外界环境胁迫。在瞬时基因表达方法中，基因枪导入法是一种比较快速有效的手段之一。通过基因枪将含有uORF片段的重组质粒DNA，打入植物组织细胞，再测定其相对荧光素酶活性，从而鉴定uORF对其翻译水平的影响。该方法的应用在分子水平鉴定uORF的作用具有重要作用。参考文献:[I] Tran M.K., Schultz C.J.&Baumann U.(2008) Conserved upstream openreading frames in higher plants.BMC Genomics 9,361.[2] Imai A.，Hanzawa Y.，Komura M.，Yamamoto K.T.，Komeda Y.&TakahashiT.(2006)The dwarf phenotype of the Arabidopsis acl5 mutant is suppressed by amutation in an upstream ORF of a bHLH gene.Development 133,3575 - 3585.[3]Wiese A., Elzinga N., Wobbes B.&Smeekens S.(2004) A conserved upstreamopen reading frame mediates sucrose-1nduced repression of translation.The PlantCell 16， 1717 - 1729.
技术实现思路
本专利技术的目的在于为鉴定植物基因中uORF片段对翻译水平的影响问题，提供。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的:一种快速鉴定UORF对翻译水平影响的方法，该方法包括下列步骤:a.对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；b.以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；c.分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；d.将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；e.培养植物组织细胞(经过22°C温室培养24小时后)，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响，即uORF对下游开放性阅读框影响。所述的方法，其中目的基因为AtHsfBl、tbz 17或AtPA03，对应的uORF片段的序列分别为 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3。所述的方法，其中步骤b中定点突变是将Met的密码子ATG突变为Leu密码子TTG，或者将ATG突变为CTG或GTG。原理就是不让启动子ATG启动。所述的方法，其中步骤a中对目的基因的uORF片断进行扩增的方法为:以植物幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，根据目的基因的uORF片段碱基序列，设计上游引物与下游引物，以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，扩增未突变uORF片段。片段可连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5 α感受态细胞，进行序列测定。所述的方法，其中步骤b中对目的基因的uORF片断进行人工定点突变并扩增的方法为:根据定点突变的uORF片段的碱基序列，设计上游引物，下游引物同未突变uORF片断的下游引物，以未突变的uORF片段为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增突变的uORF片段。片段可连接到PMD 18-T Simple载体，转化DH5ci感受态细胞，进行序列测定。所述的方法，其中步骤c中构建重组质粒采用的表达载体为pGL3_Basic。可分别用KpnI和SmaI双酶切的未突变和突变片段与KpnI和SmaI双酶切的表达载体pGL3-Basic连接，转化，提取阳性质粒，测序验证。所述的方法，其中步骤d中将重组质粒采用基因枪方法导入植物组织细胞的方法为:通过基因枪roS-1000/He (Bio-Rad)的动力系统，将吸附重组质粒的直径为0.8-1.0 μ M优选为1.0 μ M的金粉粒子，打入植物组织细胞。所述的方法，其中步骤e中比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，二者差异在两倍以上，则说明uORF对目的基因翻译水平的影响，反之，则没有影响。突变型高于未突变型两倍以上说明uORF起抑制作用，突变型低于未突变型两倍以上说明uORF起增强作用。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的方法得到突变的uORF片段，采用基因枪技术导入植物细胞，测定其相对荧光素酶活性，从而鉴定uORF对翻译水平的影响。通过利用本方法可快速鉴定基因中5'未翻译区域对下游的翻译过程所起的作用，为研究5'未翻译区域的片段在蛋白质翻译过程的作用机理提供基础。所有的uORF都可以用这种方法来鉴定其对翻译水平的影响，如果这个uORF具有保守性，那么它的影响作用将比较明显；反之，如果这个uORF不具有保守性，那么突变或者不突变，它的活性基本不变，也就是说，uORF没有影响作用。【附图说明】图1为未突变的uORF片段琼脂糖凝胶电泳分析。图中 M:DNA Marker ；1.AtHsfBl 的 uORF ；2.tbzl7 的 uORF ；3.AtPA03 的 uORF。图2为突变后的uORF片段琼脂糖凝胶电泳分析。图中 M:DNA Marker ；1.AtHsfBl 的 uORF ；2.tbzl7 的 uORF ；3.AtPA03 的 uORF。突变后的uORF片段与未突变的uORF片段长度一致。图3植物表达载体pGL3_Bas i c图谱。【具体实施方式】下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明。实施例1:拟南芥热休克转录因子基因AtHsfBl的uORF对其翻译的影响作用鉴定。拟南芥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：a.对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；b.以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；c.分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；d.将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；e.培养植物组织细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响，即uORF对下游开放性阅读框影响。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤: a.对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断； b.以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断； c.分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒； d.将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞； e.培养植物组织细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响，即uORF对下游开放性阅读框影响。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于目的基因为AtHsfBl、tbzl7或AtPA03，对应的 uORF 片段的序列分别为 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中定点突变是将Met的密码子ATG突变为Leu密码子TTG，或者将ATG突变为CTG或GTG。`4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中对目的基因的uORF片断进行扩增的方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱旭君，房婉萍，王玉花，周琳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：