本发明专利技术公开一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用。本发明专利技术首先用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀后，加入纤维素酶溶液，于10～25℃吸附1～5h；接着加入沉淀剂于4～25℃沉淀0.5～2h；接着在沉淀后的体系中加入戊二醛溶液，于25～40℃交联反应3～15h，得到磁性固定化交联纤维素酶聚集体。本发明专利技术的制备方法成本低、易于操作。本发明专利技术通过磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术有机结合，不仅提高了磁性固定化酶的活力，而且改善CLEAs操作性能差的问题，得到的既具有较高酶活力又有良好操作性能的磁性固定化交联脂肪酶聚集体性质稳定，能作为生物酶催化剂广泛应用，特别适用于大规模酶反应器。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化工领域，特别涉及一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体及其制备方法与应用。
技术介绍
纤维素酶(cellulase)是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称， 它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖，广泛用于食品、纺织、 饲料、石油勘探、中药成分提取等领域。纤维素酶最热门的应用是分解纤维类物质产生生物燃料，从而代替目前生产生物燃料所消耗的大量玉米农作物，缓解粮食对粮食消耗压力，作为石油的可持续利用替代品。但纤维素酶发酵活力较低，而且水解效率比其他糖苷酶低1-2 个数量级，这严重限制了纤维素酶的工业应用。同时，游离的纤维素酶存在稳定性差、易失活、无法重复利用的问题。加入产品中反应，会存在与产物难分离、纯化困难等问题，催化活性、使用成本和后期纯化等难题使其在工业上生产仍存在着较大困难。研究发现，磁性固定化酶具有可回收、可重复利用、操作性能好的优点，并且添加磁场后易与产物分离、可适用于大规格酶解反应器，因此近年对磁性固定化酶研究报道日益增多。我国对纤维素酶的研究主要是在高产纤维素酶菌株的筛选和基因克隆表达方面， 目前对纤维素酶固定化的研究还非常少。而且磁性固定化酶的活性相对于游离酶要低，通常只有游离酶活性40-50%，这是由于①所固定的酶蛋白的分子状态都是游离状态或自然状态，这些酶分子在固定化过程中与磁性载体作用容易失活，有时固定化酶的相对酶活仅为10%;②磁性固定化载体对酶的“活力稀释”(dilution of activity)作用，通常酶与载体的质量比不到10%，单位质量固定化酶中酶的量大大减少了。针对这些问题，目前主要的改善措施包括通过优化固定化条件来减少游离酶的失活，从而提高磁性固定化酶的活性，或者采用纳米级的磁性载体，载体较大的比表面积吸附的酶量增多，从而提高单位酶的固载量。交联酶聚集体(CLEAs)是近十年发展起来的无载体固定化酶。它通过蛋白质的盐析作用，将酶从溶液中迅速沉淀，经过交联剂固定，使酶的聚集型态固定，制备出高酶量、高酶活保留率及具有良好稳定性的固定化酶，它的催化活性比一般的吸附或交联固定化酶要高20-30%，许多的交联酶聚集体表现出超原酶活现象。同时它的制备方法简单，对酶的纯度要求不高，形成交联酶聚集体后稳定性增加，重复利用多次酶活下降不大。目前青霉素酰化酶和多种脂肪酶聚集体已实现工业化应用，具有良好的应用前景。但交联酶聚集体的结构相对而言比较疏散，用于大规模酶反应器的操作性能明显差于磁性固定化酶。工业化大规模的酶反应器为了让底物与酶催化剂充分接触，通常采用增加底物流体流动的措施，这样交联酶聚集体的结构会被破坏，降低交联酶聚集体的酶活。如何获得高酶活而操作性能好的磁性固化酶是酶生物催化工业化应用的关键难题，是酶工业化应用的瓶颈问题。磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术都酶固定化的两种新技术，对这两种技术都分别在进行着不断地改善与完善工作。但是，充分考虑两种技术的优缺点，将两种技术相结合的酶固定化技术未见报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的磁性固定化交联纤维素酶聚集体。本专利技术的再一目的在于提供所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备方法，包含以下步骤(1)纤维素酶聚集体的制备用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀后，离心后再加入纤维素酶溶液中，于10 25°C吸附1 证；接着加入沉淀剂于4 25°C 沉淀0. 5 2h，此时未被磁性壳聚糖微球吸附的游离纤维素酶将形成具有一定空间结构的纤维素酶聚集体，沉淀在磁性壳聚糖复合微球表面；(2)磁性固定化交联纤维素酶聚集体的制备在上述沉淀后的体系中加入戊二醛溶液，得到反应体系，在50 200r/min的搅拌速度下，于25 40°C交联反应3 15h，用磁铁分离，最后用蒸馏水充分洗涤至不再检出蛋白质后，得到磁性固定化交联纤维素酶聚集体。所述的磷酸缓冲液优选为pH5. 0 8. 0、浓度0. 05 0. 2mol/L的磷酸缓冲液；步骤(1)中所述纤维素酶溶液优选使用上述磷酸缓冲液配制得到；步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球优选通过包含如下步骤的制备方法制备得到①将壳聚糖溶解在体积浓度为1. 0 3. 0%醋酸溶液中，得到均一透明的壳聚糖浓度为质量体积比1. 0 4. 0%的胶体溶液；接着加入!^e3O4纳米颗粒，Fe3O4纳米颗粒的用量相当于前述胶体溶液中壳聚糖质量的1/4 1，超声作用下分散，得到分散均勻的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用；②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液；司班与吐温按质量比1 4 1配比， 液体石蜡占液体石蜡油相溶液的质量百分比85 95% ；③将步骤①制备的磁性壳聚糖胶体溶液滴入在搅拌状态下的液体石蜡油相溶液， 磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液按体积比1 2 4配比；接着搅拌10 40min 后迅速加入戊二醛溶液，控制戊二醛最终浓度为体积百分比0. 2 1. 0%，继续搅拌40 120min，调节pH值为9 11，于60 80°C条件下反应60 120min，最后经磁铁吸附，洗涤，干燥，得到磁性壳聚糖复合微球。步骤①中所述的Fii3O4纳米颗粒的粒径范围优选为50 300nm ；步骤①中所述的超声分散的条件优选为20 40KHz分散10 40min ；步骤②中所述的司班优选为司班-80或司班-65 ；步骤②中所述的吐温优选为吐温-80或吐温-65 ；步骤③中所述的洗涤优选为依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤；步骤③中所述的干燥优选为真空干燥；步骤(1)中所述的充分溶胀为磁性壳聚糖复合微球溶胀至体积不再变大；步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液的用量优选为按每Ig磁性壳聚糖复合微球配比 20 50mL磷酸盐缓冲液计算；步骤(1)中所述的溶胀的时间优选为10 Mh ；步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球和所述的纤维素酶优选按质量比5 30 1配比；步骤(1)中所述沉淀剂优选为硫酸铵、聚乙二醇中的至少一种；所述的硫酸铵的溶液的饱和度优选为60 95 % ；所述的聚乙二醇优选为PEG6000或PEG4000 ；所述的聚乙二醇的质量浓度优选为40 60% ；步骤(1)中所述的纤维素酶溶液的浓度优选为3 10mg/mL ；所述的纤维素酶溶液的用量优选为1 IOmL ；所述的纤维素酶溶液与所述的沉淀剂溶液优选按体积比1 1 10配比。步骤O)中所述的戊二醛在反应体系中的最终浓度优选为0. 03 0. 3% ；更优选为 0. 05 0. 1%。一种磁性固定化交联纤维素酶聚集体，通过上述方法制备得到；所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体的酶活回收率在55 83%，最重要的是重复利用10次后，酶活回收率下降幅度不大；而未经过沉淀制备的固定化交联酶在重复利用10次后，酶活回收率下降幅度大。所述的磁性固定化交联纤维素酶聚集体在食品领域、生物领域或医药领域中作为生物酶催化剂进行应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本专利技术将CLEAs技术引入磁性固定化酶的制备，实现磁性载本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李冰，李琳，谢晓灵，李晓玺，陈玲，苏健裕，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。