采用鉴定剂分离和表征微生物的方法技术

本发明专利技术涉及用于分离、表征和／或鉴定测试样品中的微生物的方法。本发明专利技术的方法包括用于溶解可能存在于测试样品中的非微生物细胞的可选溶胞步骤，接着是一个后续的分离步骤。该方法可以用于从复杂样品诸如含血液的培养基中分离、表征和／或鉴定微生物。本发明专利技术进一步提供了一种或多种鉴定剂的应用和探询微生物样品和／或所述一种或多种鉴定剂以产生表征和／或鉴定微生物的测定结果，这种表征和／或鉴定是基于所产生的测定结果和／或在微生物样品中存在或不存在鉴定剂或鉴定剂的代谢形式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测、分离和/或鉴定样品中微生物的方法和系统。而且，本专利技术涉及利用鉴定剂强化表征和/或鉴定微生物的方法。
技术介绍
检测生物学流体中的病原微生物，应该在尽可能最短的时间内进行，尤其是在败血症的情况下，对于该病症尽管医生可利用的抗生素的范围广泛，但是其死亡率仍然保持较高。生物学活性剂(诸如微生物)在患者体液尤其是血液中的存在，一般采用血培养瓶进行检测。血流感染与高的发病率和死亡率有关，然而当前的诊断方法即培养之后进行生物化学鉴定和抗生素敏感性测试，可能要耗费几天时间来进行。通常，基于临床症状开始经验疗法，而只有当初始疗法失效时测试结果才会影响临床决策。在阳性血液培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内表征血液感染的能力，将会显著地加强所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出了分子扩增方法来填补这方面的需要，但是对于这种方法仍然存在严重的挑战。阳性血液培养液自身代表具有用于各种快速、鉴定(ID)试验的潜能的天然扩增的微生物种群。为了提供稳健的结果，传统的自动表型ID测试(诸如Vitek 、Phoenix 和 Microscan 系统)或手动表型测试(诸如API)要求微生物处于适当的生长阶段并且无干涉培养基和血液产物。这些系统利用在平板培养基上从阳性培养液中生长18 M小时的菌落。然而，为了获得更快的结果，一些实验室已经报道了采用这些系统及从阳性血培养瓶中分离的微生物。这些直接获自培养瓶的试验并不是对于所有的微生物(例如，革兰氏阳性球菌)都是适当的，未经测试厂商验证，并且一般要花费3 8小时才能提供结果。迫切需要更快且更广泛的特异性试验，以便在阳性培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内为医师提供临床上相关的结果。光学光谱学方法诸如内荧光(IF)、红外光谱法(FTIR)或拉曼光谱法，以及质谱方法诸如MALDI-T0F，都具有实现非常快速地鉴定微生物的潜能，但是可能会遇到在液体微生物培养基中和临床样品诸如血液或其组合中存在的许多高度荧光和吸收性化合物的干扰。 直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两步差速离心和在血清分离器管中的离心。已经描述了用于分离、表征和/或鉴定微生物的其它方法，包括美国专利第4，847，198号公开了一种利用UV激发拉曼光谱法鉴定微生物的方法。 根据'198专利，通过紫外光谱范围内的单波长接触细菌悬浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被发射。发射的光能，共振增强拉曼散射，作为反向散射能量进行测定。对该能量进行处理以产生细菌的特征性光谱。Vo-Dinh的美国专利第5，938，617号涉及一种系统，该系统通过用几个波长的光激发样品并同步采集发射强度来鉴定样品中生物病原体。系统包括用于将样品暴露于激发辐射并由此产生发射辐射的机制。生物病原体可能是病毒和细菌。美国专利第6，177，266号公开了一种采用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MQ分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株的特异性生物标记对细菌进行化学分类学分类的方法。在美国专利第7，070, 739号中，显示了一种通过二维超离心直接从体液或均质化组织中提取、分离和纯化微生物(包括病毒)的方法。在第一步离心步骤中，将沉降速度高于待鉴定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超离心步骤中，采用专用锯齿离心管，于填充的流体中应用等密度分带以形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术能够用于通过利用核酸特异性染料的光散射或荧光检测分带的粒子，以及用于以非常小的体积回收分带的粒子，从而通过质谱分析病毒蛋白亚单位和完整的病毒粒子以及通过荧光流量细胞计数测定核酸的质量和由限制酶产生的片段的质量进行表征。美国专利申请出版物第2007/0037135号公开了一种用于鉴定和定量悬浮于液体中的生物样品的系统。该系统包括具有至少一个激发光源的荧光激发模块；样品界面模块， 其可选地耦合到荧光激发模块用于定位生物样品以接受来自至少一个激发光源的激发光； 荧光发射模块，其可选地耦合到样品界面模块并包含至少一个用于检测生物样品的荧光激发-发射矩阵的检测仪；和计算机模块，其经过操作耦合到荧光发射模块。计算机模块对生物样品的荧光激发-发射矩阵进行多变量分析以鉴定和定量生物样品。然而，‘135申请并未讨论从复杂生物学样品诸如血液中鉴定和定量微生物。美国专利申请出版物第2007/0175278号描述了采用液体培养基培养所关注的样品，包括例如血液、尿液、粪便、脉管导管等，工业生产线，水系统，食物产品，化妆品，药物制剂和法医样品。随后，通过本领域内已知的方法，例如通过离心可以从液体培养基中收集微生物。然后可以将浓缩的微生物转移到载体物质中，可选地在干燥之后，用于获取振动光谱。该专利申请讨论了用于鉴定和分类微生物的各种方法，包括振动光谱法，诸如拉曼光谱法。然而，这些方法在试图从复杂样品(诸如含血液的培养基)中分离和表征微生物时具有一些缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血细胞、血小板、脂质微粒、血浆酶和细胞碎片，这些都可以导致结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的并且由于其步骤能够使潜在危险的病原体在空气中暴露于使用者从而是不安全的。仍需要从临床样品 (例如，血液培养液)和其它无这些干扰物质并与快速鉴定技术相容的复杂样品中分离微生物的安全且可靠的方法。
技术实现思路
本专利技术提供用于分离、表征和/或鉴定样品中微生物的方法。方法实现了比现有技术更快速地表征和/或鉴定微生物，从而更快地诊断(例如，在患有或疑似患有败血症的受试者中)并鉴定受污染物质(例如，食品和药物)。在本专利技术的方法中所包括的步骤，从获得样品到表征和/或鉴定微生物，都可以在非常短的时间框架内实施以产生临床相关的可采取行动的信息，例如在不到约120分钟内。另外，可以使本专利技术的方法完全自动化，由此降低处理传染性物质和/或污染样品的风险。在一个方面中，本专利技术涉及表征和/或鉴定微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)将测试样品铺层于容器中的密度缓冲垫层的上方；(c)向所述测试样品和/或所述密度缓冲垫层中加入鉴定剂；(d)将所述容器离心以使微生物与所述测试样品的其它组分分离并形成微生物颗粒；(e)对所述颗粒和/或所述一种或多种鉴定剂进行探询以产生鉴定微生物的测定结果；和(f)基于所产生的测定结果和/或在颗粒中存在或不存在所述鉴定剂或所述鉴定剂的代谢形式来表征和/或鉴定颗粒中的微生物。在另一个方面中，本专利技术涉及分离和鉴定微生物的方法，包括(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；(b)可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品；(c)使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离以形成微生物颗粒；(d)探询该颗粒以产生鉴定微生物的测定结果；(e)基于所产生的测定结果鉴定微生物；和(f)回收至少部分的颗粒以产生回收的微生物；(g)对所述回收的微生物实施一种或多种进一步的测试。在一个实施方式中，分离通过将样品铺层在容器中的密度缓冲垫层上方并将容器离心以粒化微生物，同时样品培养基仍保持在密度缓冲垫层的顶部来实施。在另一个实施方式中，容器在底部和/或侧面上具有光学窗口以便使微生物颗粒能够进行光谱学上的探询。可以通过将颗粒的光谱与已知微生物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种表征和／或鉴定微生物的方法，包括：（ａ）获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；（ｂ）将测试样品铺层于容器中的密度缓冲垫层的上方；（ｃ）向所述测试样品和／或所述密度缓冲垫层中加入鉴定剂；（ｄ）将所述容器离心以使微生物与测试样品的其它组分分离且形成微生物颗粒；（ｅ）对所述颗粒和／或所述一种或多种鉴定剂进行探询以产生鉴定微生物的测定结果；和（ｆ）基于所产生的测定结果和／或在颗粒中存在或不存在所述鉴定剂或所述鉴定剂的代谢形式来表征和／或鉴定颗粒中的微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·沃尔什，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：US