本发明专利技术总体而言涉及心力衰竭，并且具体而言涉及一种降低心力衰竭风险的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体而言涉及心力衰竭，具体而言涉及降低心力衰竭风险的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。
技术介绍
造成心脏病的发展和严重性的遗传因素很难被识别，很大程度上是因为人群中临床结果的规范化带来的挑战。因此，正向遗传学方法在识别新型药物作用靶点方面仅取得了有限的成就。肌集钙蛋白(CSQ)转基因小鼠的心肌病模型(Jones et al,J. Clin. Invest. 101 1385-1393(1998)，Cho et al, J. Biol. Chem. 274 :22251-22256(1999))在依赖于遗传背景的表型发展方面显示出很大的差异(Suzuki et al, Circulation 105 :1824-1829(2002), Le Corvoisier et al，Hum. Mol· Genet. 12 :3097-3107 U003))。使用 CSQ转基因致敏原的数量性状基因定位(QTL)已获得了七种缓和疾病进展和结果的心力衰竭修饰基因(Hrtfm)位 (Suzuki et al, Circulation 105 :1824-1829(2002), Le Corvoisier et al, Hum. Mol. Genet. 12 :3097-3107(2003)，Wheeler et al, Mamm. Genome 16:414-423(2005))。在两种不同杂交体中定位的Hrtfm2 (Suzuki et al, Circulation 105 :1824-1829 (2002) ,Wheeler et al，Mamm. Genome 16 :414-423(2005))占存活者中表型变异数的观 30%，并占心功能中变异数的22 42%。本专利技术至少部分源于将Tnni3k(心肌肌钙蛋白I相互作用激酶)作为Hrtfm2的基础基因的识别。
技术实现思路
本专利技术总体而言涉及心力衰竭。更具体而言，本专利技术涉及预防和/或降低患有心肌病的患者的心力衰竭危险性的方法。本专利技术还涉及识别适合在为预防心力衰竭而设计的治疗策略中使用的药剂的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。根据后面的描述，本专利技术的目的和优点将会更加清楚。附图说明图IA 图IC :Tnni3k mRNA和蛋白表达在各小鼠品系之间变化明显。㈧ Affymetrix基因芯片分析在小鼠3号染色体上仅识别出一种在B6、AKR和DBA之间具有明显表达变化的基因。示出了两种侧接于Tnni3k的基因(Cryz和Lrrc44)，它们在所有品系中以类似的水平表达，还示出了两种对照基因Actb ( β -actin)和Gapdh。(B) qRT-PCR确认了通过基因芯片分析识别的表达差异。来自于每一品系的5只野生型小鼠心脏的Trmi3k的 TaqMan qRT_PCR确认了在B6和AKR中的转录水平比DBA高(大约为25倍)(**p > 0. 0001 以及*ρ > 0. 001)。来自于Hrtfm2同类系并且在DBA遗传背景的Tnni3k位点上包藏有AKR 等位基因(DBA. AKR-Hrtfm2)的三个心脏显示出与B6和AKR心脏类似的转录水平，其明显高于在DBA心脏中观测到的水平广p> 0.0001)。Actb作为内源对照。误差线指示出平均数标准误差(SEM)。(C)蛋白质印记分析表明，三种在Trmi3k处共为DBA单倍型的品系未显示出可检测到的Tnni3k蛋白，而三种具有B6单倍型的品系显示出中等至较高的表达水平。 如基于RNA表达所预期的那样，DBA.AKR-Hrtfm2同类小鼠显示出高的表达水平。将在心脏中显示出中等表达水平的受体酪氨酸激酶Tek(http://symatlas. gnf. org/SymAtlas/)用 1 白负冑胃照(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 图2 :来自Tnni3k基因组区域的编码和代表性非编码多态SNP显示出两个不同的单倍型组。这两种SNP单倍型与Tnni3k转录水平相关。第1组(DBA、C3H和Balb/c)显示出低水平的TnnUk，而第2组(B6、AKR和129Sv)显示出高水平的Tnni3k。图3 对C末端小鼠Trmi3k肽进行了多克隆抗体的蛋白质印记分析。对照印记表明，来自细胞的裂解物用小鼠Trmi3k表达载体或空载体对照瞬时转染。Trmi3k蛋白在阳性对照裂解物中可见，尺寸如所预期的那样为大约90kDa。还示出了来自DBA、AKR和 B6小鼠的心脏裂解物。DBA并未显示出Tnni3k蛋白，而AKR和B6显示出强劲的蛋白表达水平。图4A 图4D 来自DBA小鼠的心脏中的Tnni3k异常拼接。㈧测序谱图显示出来自B6和DBA心脏的Tnni3k cDNA中的外显子19-20的边界。虚线显示出源自内含子19 的4核苷酸cDNA插入物(GTTT)的第一个碱基。可看到DBA中正确拼接的转录物的一小部分与虚线之后的序列重叠。(B)具有侧接内含子序列以及B6 (第1位点/正常)和DBA (第 2位点/异常)氨基酸编码的外显子19和20的序列。4核苷酸GTTT插入物以粗体示出。 (C)使用荧光片段分析(GeneMapper，Applied Biosystems)以确定DBA中异常拼接的百分比。DBA中几乎70%的总信息被误拼接，而在B6和AKR中没有观察到异常拼接。⑶使用简单加法数学模型(Staden，Nucleic Acids Res. 12 :505-519 (1984),Burset et al,Nucleic Acids Res. 28 :4364-4375(2000))来计算不同拼接供体位点的权重矩阵打分。示出了各种供体位点的算出的强度。图5A和图5B :rs57952686处的序列是异常Tnni3k拼接的原因。使用体外体系来测试内含子19SNP(rs57952686)在外显子19和20之间异常拼接的作用以及在DBA中与在B6中的对比。(A)用于测试异常拼接的Trmi3k外显子18-20体外拼接构造体的示意图。 将来自于DBA和B6，包括外显子18、19和20的基因组片段扩增并克隆到pSPL3拼接载体中。此外，利用定位诱变来改变各构造体中rs5795^586处的序列。将拼接构造体转染到细胞中，48小时后收获RNA。(B)对Tnni3k拼接的分析揭示出，体外DBA构造体的异常拼接与野生型DBA心脏中的拼接非常相似，但B6的体外构造体中没有异常转录。当内含子19中的+9位的关键核苷酸在各构造体之间交换时，拼接模式遵循SNP处的序列，表明 rs57952686处的序列是拼接缺陷的原因。图6A和图6B 无义介导的衰变是降低的Tnni3k转录水平的原因。用吐根碱或放线菌酮来处理HL-I心肌细胞以阻塞NMD。从处理M小时后的细胞中分离出RNA。利用荧光RT-PCR片段分析来测定异常对野生型转录物的比率，并利用qRT-PCR来确定相对于actb 的Trmi3k信息水平。将模拟处理的细胞作为对照。(A)吐根碱和放线菌酮的处理都很好地提高了异常拼接信息相对于正常拼接信息的水平Γρ > 0. 01)。(B)吐根碱和放线菌酮的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种识别心肌肌钙蛋白Ｉ相互作用激酶（Ｔｎｎｉ３ｋ）活性的候选抑制剂的方法，包括：ｉ）用一种测试化合物来孵育Ｔｎｎｉ３ｋ或其片段，并且ｉｉ）分析所述测试化合物与所述Ｔｎｎｉ３ｋ或所述其片段的结合，其中能与所述Ｔｎｎｉ３ｋ或所述其片段结合的一种测试化合物为Ｔｎｎｉ３ｋ活性的候选抑制剂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯·A·马尔丘克，
申请(专利权)人：杜克大学，
类型：发明
国别省市：US
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