皮肌炎的诊断方法和诊断试剂盒技术

本发明专利技术的目的是鉴定与抗ＣＡＤＭ－１４０抗体相应的抗原，生产重组蛋白，并建立通过ＥＬＩＳＡ等的测定系统。本发明专利技术提供了诊断皮肌炎的试剂盒，该试剂盒包含由抗ＣＡＤＭ－１４０抗体识别的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示的ＭＤＡ５蛋白或其片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及诊断皮肌炎的方法和试剂盒，以及用于诊断皮肌炎的抗原蛋白的用途。
技术介绍
胶原病使其被视为自身免疫性疾病的基本特征是产生抗多种细胞组分的自身抗 体。已知对应这些自身抗体的许多抗原是生命过程中必不可少的酶和调节因子。预期研究 自身抗体及其对应抗原(自身抗原)的分子结构以及它们的生物学功能有助于阐明结缔组 织病的病理。多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)为炎性肌病，其中主要是骨骼肌炎症所引起的近端 肌无力和肌肉疼痛。特别是当观察到典型皮肤症状如向阳性皮疹和Gottron氏丘疹时，患 者被诊断为DM。多发性肌炎/皮肌炎是一种自身免疫性疾病，并且已知产生了多种自身抗 体。已经报道了在PM/DM患者血清中存在抗体；这些抗体包括在肌炎患者中特别检测到的 抗氨酰tRNA合成酶抗体(抗ARS抗体)、抗SRP抗体、抗Mi_2抗体和类似抗体以及抗UlRNP 抗体、抗SS-A抗体和与肌炎相关的类似自身抗体。已知的是，对于相同肌炎特异性自身抗 体为阳性的患者表现出相似的临床特征；这对于诊断、疾病类型分类、适当治疗方法的选择 和预后评估在临床上是有用的。相比之下，自身抗体阴性被认为是PM/DM亚型临床无肌病性DM(C-ADM)的特征之 一。C-ADM特异性自身抗体的存在是未知的。已知C-ADM抵抗临床治疗，并且与不良预后的 急进性间质性肺疾病(RP-ILD)有关。为了挽救患有RP-ILD的C-ADM患者的生命，已报道 和推荐联合利用高剂量类固醇疗法和免疫抑制药物给药的早期有效治疗的功效。因为这个 原因，具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断在临床上是重要的，并且期望建立用于早期诊 断的新指标。根据以上背景，本专利技术人根据免疫沉淀(IPP)法研究了正常健康对照、患有包括 C-ADM在内的结缔组织病的患者以及患有特发性肺纤维化的患者的血清。本专利技术人发现 C-ADM患者的血清中存在能够识别一种140-kDa蛋白的新自身抗体，并且将该新自身抗体 命名为“抗CADM-140抗体”(非专利文献1 (NPL 1))。抗CADM-140抗体在患除C-ADM以外的结缔组织病患者、特发性肺纤维化患者和正 常健康对照中的任一组均未检测到。临床上观察到抗CADM-140抗体阳性患者中RP-ILD显 著地频繁发生，这表明抗CADM-140抗体与RP-ILD之间存在关联(非专利文件2)。该现象被认为对于预后特别不良的具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断和治疗 选择是有用的，并因此希望改善其预后。MDA5 具有 SNP (http//www, ncbi. nlm. nih. gov/SNP/snp ref. cgi ？ IocusId = 64135)。其氨基酸序列和碱基序列的NCBI登录号为NM_022168。专利文献1 (PTL 1)公开 了 MDA5和癌症之间的关系。本专利技术人发表了非专利文献3 (NPL 3)，其公开了本专利技术所涉及的技术。引文目录专利文献PTL 1 日本未经审查的专利文件2003-531581号非专利文献NPL 1 =Arthritis Rheum. 46(9) :S398，2003NPL 2 =Arthritis Rheum. 52(5) :1571-1576,2005NPL 3 =Arthritis Rheum. 60(7) :2193-2200,2009专利技术概述技术问题根据IPP方法，利用S35标记的白血病来源的K562细胞提取物或HeLa细胞对抗 CADM-140抗体进行了一般测量。虽然这是具有高灵敏度和高特异性的可靠测量方法，但是 该方法使用同位素并需要复杂的程序。因此，该测量方法仅在数量有限的实验室中使用。为了将抗CADM-140抗体的测量应用到实际临床诊断中，亟需建立能够容易地测 量大量样品的测量系统。鉴定与抗CADM-140抗体相应的抗原、制备重组蛋白及建立通过 ELISA的测量系统等对于建立该系统是重要的。问题的解决方案本专利技术人利用HeLa细胞cDNA文库克隆与抗CADM-140抗体相应的抗原基因，并且 研究了该相应抗原蛋白的分子序列。结果，本专利技术人发现MDA5(黑色素瘤分化相关基因5) 为与抗CADM-140抗体相应的抗原，并在这一发现的基础上完成本专利技术。本专利技术提供了用于皮肌炎诊断的试剂盒和方法，如下逐项所述。项1.用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO 4 所示的MDA5蛋白或其片段。项2.根据项1的用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO 2所示的MDA5蛋白C-末端片段或其片段。项3.根据项1的试剂盒，其中所述皮肌炎为与发生急进性间质性肺疾病的高风险 有关的临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)。项4.根据项1的试剂盒，其用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的测量。项5.根据项1的试剂盒，其包含(i)抗原，其包含MDA5蛋白或其免疫原性肽；(ii)介质，其适用于个体的样品与所述抗原⑴之间的反应；(iii)试剂，其用于检测所述抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物；以及任选的(iv)参照样品，其不含抗CADM-140抗体。项6.用于诊断皮肌炎的方法，其包括使个体的样品与由抗CADM-140抗体识别的 MDA5蛋白或其片段反应；以及当在所述样品中检测到抗CADM-140抗体时诊断该个体患有 皮肌炎。项7.根据项5的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。项8.根据项6的方法，其中所述样品中的抗CADM-140抗体通过ELISA来检测。项9.根据项6的方法，其包括以下步骤(i)将特定量的本专利技术的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的样品稀释，并将稀释后的样品添加至所述孔；(iii)孵育后洗涤所述微量滴定板；(iv)将标记的抗人免疫球蛋白抗体引入所述微量滴定板的孔；并且(ν)通过与对照比较来检测与抗体结合的标记的量。项10.由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段用于诊断皮肌炎的用途。专利技术的有益效果根据本专利技术可以高准确性地检测预后特别不良的临床无肌病性皮肌炎，其与发生 预后特别不良的急进性间质性肺疾病的高风险有关。本专利技术能够快速测量许多样品中的抗CADM-140抗体。这对于具有相关RP-ILD的 C-ADM的早期诊断和治疗选择是有益的，并且期望改善该疾病的预后，该疾病的治疗方法尚 未建立并且被认为是预后特别不良的疾病。此外，抗CADM-140抗体阳性样品的累积使得能 够分析外源性抗原，诸如为特异性自身抗体靶标的病毒，并且有助于阐明具有相关RP-ILD 的C-ADM的发病机理。附图简述附图说明图1示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8 (MDA5)蛋白与C-ADM患者血 清之间反应的结果，该研究在纯化克隆#8 (MDA5)蛋白并利用体外转录/翻译系统证实该蛋 白表达后进行。克隆#8(MDA5)与所有抗CADM-140抗体阳性血清样品反应，但它不与正常 健康对照血清反应。图2示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8 (MDA5)重组蛋白与抗 CADM-140抗体阳性C-ADM患者、患有其他结缔组织病的患者以及正常健康对照的血清之间 反应的结果，该研究在纯化克隆#8本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗ＣＡＤＭ－１４０抗体识别的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示的ＭＤＡ５蛋白或其片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑名正隆，
申请(专利权)人：学校法人庆应义塾，
类型：发明
国别省市：JP