本发明专利技术提供了包含编码蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）半胱氨酸簇蛋白质的多核苷酸的抗线虫的转基因植物和种子，所述蒺藜苜蓿半胱氨酸簇蛋白质在各自的成熟肽中包含不多于４个半胱氨酸残基。本发明专利技术也提供了产生具有对大豆胞囊线虫增加的抗性的转基因植物的方法以及用于此类方法中的表达载体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过使用抗线虫的转基因植物和种子增强农业生产力，以及制备此类 植物和种子的方法。
技术介绍
线虫是以2000多种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物为食的微小线虫动物，在全 世界引起大约1千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫 (root-knot nematode) (RKN)、胞囊形成线虫(cyst-forming nematode)禾口病变形成线虫 (lesion-forming nematode) 0以在进食位点引起根虫瘿形成为特征的根癌线虫，具有相对 广的宿主范围并因此寄生在多种作物物种上。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限 的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。寄生线虫目前遍及整个美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域以及在沙质土壤中 发生最为密集。1%4年，首次在美国北卡罗莱纳州发现了大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode) (Heterodera glycines)，其是大豆植物最严重的害虫。一些地区受到大豆胞囊 线虫(SCN)侵染太严重，以至于不采取控制措施，大豆产量将不再是经济上可行的。尽管 大豆是受到SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约50种宿主，包括大田作物、蔬 菜、观赏植物和杂草。线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫感 染可以在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量降低的主要原 因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根 上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物线虫的攻击。线虫的生活史具有三个主要的阶段卵、幼体和成体。线虫物种之间生活史不同。 SCN的生活史类似于其他植物寄生线虫的生活史。在最佳的条件下，SCN的生活史通常可以 在M到30天内完成，然而其他物种可能需要1年或者更长以完成生活史。在春天，当温度 和湿度水平变得有利的时候，在土壤中，虫状的幼体从卵中孵化。只有在幼体发育阶段的线 虫能感染大豆根。在渗透入大豆根后，SCN幼体移动穿过根直到它们接触到维管组织，在那时，它们 停止迁移并开始进食。通过口针，线虫注射修饰某些根细胞的分泌物并将它们转变成专门 的进食位点。根细胞在形态上被转化成作为线虫的营养来源的大型多核合胞体(或者在 RKN的情况下为巨大细胞)。因此，主动进食线虫从植物中盗取基本营养物质，造成了产量 损失。随着雌性线虫进食，它们开始膨大并最终变得太大以至于它们的身体突破了根组织 并暴露于根的表面。在一段时间的进食后，没有如成年雌性膨大的雄性SCN，迁移到根的外面进入土壤 中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系统并继续进食。在膨大的 雌性内的卵开始发育，最初在体外的团块(mass)或卵囊内，并然后随后在线虫体腔内。最 终，整个成年雌性体腔都充满了卵，且线虫死去。死亡雌性的充满卵的身体称为胞囊。胞囊 最终扩散并在土壤中可随意发现。胞囊的壁变得非常坚硬，为包含在其中的大约200至400个卵提供良好的保护。SCN的卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件出现。尽管许多卵可以 在第一年内孵化，但是许多卵也会在保护性胞囊中存活几年。线虫在土壤中以其自身的能力每年仅可以移动几英寸。然而，线虫感染可以以多 种方式传播到相当远的距离。任何移动受感染土壤的东西都能传播感染，包括农业机械、车 辆和工具、风、水、动物和农场工人。土壤的种子大小颗粒常常污染收获的种子。因此，当从 受感染的田地的受污染的种子播种在未受感染的田地的时候，线虫感染可以传播。甚至有 证据表明，某些线虫物种可以通过鸟类传播。这些原因中仅有一些可以预防。用于管理线虫感染的常规方法包括在受线虫感染的土地中保持合适的土壤营养 和土壤PH水平；控制其他植物疾病，以及昆虫和杂草害虫；仅在耕种了未感染田地后使用 卫生实践，如线虫感染田地的耕作、种植和栽培；在受感染的田地作业后，用高压水或者蒸 汽彻底清洁设备；不使用在受感染的土地上生长的种子用于种植未感染的田地，除非种子 已经适当地清洁；轮作受感染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种 植抗性植物品种。已经提出了用于植物的基因转化的方法以赋予对植物寄生线虫增加的抗性。例 如，美国专利号5，589，622和5，824，876涉及在受到线虫附着后在植物的进食位点内或者 附近特异表达的植物基因的鉴定。许多方法涉及用能抑制基本线虫基因的双链RNA来转化 植物。其他农业生物技术方法提出过表达编码对线虫有毒性的蛋白质的基因。当受到根瘤菌属的共生土壤细菌感染的时候，豆科植物例如大豆和苜蓿产生了特 化的根瘤。一旦在根瘤内建立，根瘤菌固定大气氮，使其可以为植物所用。由于氮作为植物 营养的基本作用，在根瘤中的氮固定对于农业是重要的。许多植物基因，称为“根瘤蛋白”优 先地表达在根瘤中。根瘤蛋白基因编码多种蛋白质，包括豆血红蛋白、尿酸酶、谷氨酰胺合 成酶、蔗糖合成酶和大量未知功能的其他蛋白质。一类蒺藜苜蓿(Medicago trunculata)根瘤蛋白基因编码富含氨基酸半胱氨酸的 小蛋白质，称为“半胱氨酸簇蛋白质”或者“CCP”。CCP的一种亚类以N末端信号肽；小的、 高电荷的极性成熟肽；以及在成熟肽内形成两个二硫键的4个半胱氨酸残基的特征性排列 为特征。这种CCP亚类通过半胱氨酸残基的数目与其他蒺藜苜蓿(M. trunculata) CCP亚类 区别其他CCP在成熟肽中含有6个、8个或者10个半胱氨酸残基，且在成熟肽中可能形成 多于2个二硫键。除了每一亚类的成员都共有的半胱氨酸的特征性排列外，CCP表现出相 对低水平的氨基酸同一性。含有多于4个半胱氨酸残基的蒺藜苜蓿CCP成熟肽的二硫桥模式与植物防卫素 的二硫桥模式类似，所述植物防卫素是低分子量半胱氨酸富集的抗微生物和抗真菌蛋白 质。植物防卫素包含形成4个结构稳定化二硫桥的8个半胱氨酸。植物防卫素的三维结构 以“半胱氨酸稳定的α β ”或者“CS α β ”基序为特征，所述“半胱氨酸稳定的α β ”或者 "CSa β ”基序为来自昆虫、蝎子、蜜蜂和蜘蛛毒液的毒素所共有。短链毒素例如蝎子毒素与 K+通道或者Cl—通道结合。美国专利号6，121，436 ；6, 316，407和6，916，970公开了蒺藜苜蓿防卫素AFPl和 AFP2。将AFPl基因转化入马铃薯中处于组成型FMV启动子的控制下，得到的转基因植物在 温室中和田间试验中都表现出对真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)增加的抗性。 (Gao等(2000) Nat. Biotechnol. 18，1307)。尽管有这些积极的结果，但是到目前为止还没有商业化的包含编码AFPl防卫素的转基因的转基因马铃薯。美国专利号6，911，577和7，396，980公幵了编码来自稻(Oryza sativa)、玉蜀黍 (Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、舌甘菜(Beta vulgaris)、常(Hedera helix) λ^ΜΜ^ΙΡ^^ (Tulipafosteriana)(Tulipa gesneriana)本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用表达载体转化的转基因植物，所述表达载体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种蒺藜苜蓿（Ｍ．ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ）基因，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于４个半胱氨酸残基的ＣＣＰ成熟肽。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·P·罗哈，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE
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