本发明专利技术提供了分离的结核分枝杆菌蛋白，其为推定的乙酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲＩ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及其免疫原性肽片段，以及针对所述全长蛋白和免疫原性肽片段产生的抗体用于在人中诊断由一种或多种结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌造成的感染和／或结核病，例如使用基于抗原的夹心ＥＬＩＳＡ形式。本发明专利技术还提供了多分析物测定法，其中本发明专利技术基于ＫＡＲＩ的诊断测定法与检测一种或多种来自一种或多种所述分枝杆菌的其他蛋白的免疫原性表位多路并联（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ），所述其他蛋白例如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１４、２１、２８－２９、３６或４４中任一，包括其任意组合。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的针对由结核分枝杆菌(M. tuberculosis)造成的动物受试者(如 人)的感染和与该感染相关的病状(如，例如，结核病)的诊断性、预后性和治疗性试剂。更 具体而言，本专利技术提供了第一个能够实现的对如下内容的公开，即在受感染的受试者中表 达适用于制备免疫性(immune-logical)试剂，如，例如，抗原性蛋白/肽和/或抗体的结核 分枝杆菌的乙酮醇酸还原异构酶(Ketol-acid reductoisomerase，KARI)蛋白(SEQ ID NO: 1)及其免疫原性表位以供感染的诊断、预后和治疗，以及疫苗开发。
技术介绍
相关技术的描述结核病是慢性的传染性疾病，其通常由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis)或结核分枝杆菌复合菌组(complex)中的一种或多种生物 的感染而导致。本文中使用的术语“结核分枝杆菌复合菌组”指一种或多种选自下组的生 物结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M. bovis)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、M. canetti和田 鼠分枝杆菌(M. microti)。本领域技术人员还知道所述结核分枝杆菌复合菌组与所谓的鸟 分枝杆菌(Mavium)复合菌组(包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(M. intracellulaire)) 不同，后者为称作类结核病的不相关疾病(例如，在农用动物中)的病原体。结核病是发展中国家中的主要疾病，并在世界上发达区域也日渐称为问题，每年 有8百万新病例以及3百万死亡。虽然感染可在相当时间内无症状，该疾病最常见地表现 为肺的急性炎症，导致发烧和排痰性咳嗽。如果放置不予治疗，结核分枝杆菌可进展至肺中 的原发感染位点以外的身体中的其他器官，并通常导致严重的并发症和死亡。医疗工业的许多从业人员常常描述全球结核病发病率和微生物抗性正在快速增 长的问题，所述问题对于本领域技术人员是公知的。具体而言，越来越认识到迫切需要新的 诊断方法、药物和疫苗。对结核分枝杆菌在宿主体内维持并繁殖的免疫学机理所知不多。因此，关于肺结 核和宿主之间的免疫性关系的任何新信息显然可以以许多不同的方式用于促进该疾病的 诊断、治疗和处理。结核病在晚期AIDS患者中的发病特别常见，大部分患者罹患该病。事实上，HIV 感染是在纯化的蛋白衍生物(PPD)-结核菌素-阳性受试者中形成活性结核病(active tuberculosis)的最重要的风险因素(risk factor)，且在经HIV感染的免疫抑制个体中与 未经HIV感染的个体相比较可显著地增强遭受结核病感染的风险。还可能HIV-I和结核分 枝杆菌的共感染介导了缩短的无HIV症状期，并缩短了受试者的存活时间，这可能是通过 触发病毒复制和病毒载量的增加，其导致CD4+T细胞耗尽和免疫缺陷或免疫抑制(Corbett11等，2003 ；Ho, Mem. Inst. Oswaldo Cruz，91，385-387，1996)。结核分枝杆菌基因组的测序促进了大量鉴定可由结核分枝杆菌表达的潜在的结 核分枝杆菌蛋白的研究努力。然而，序列数据本身并不足以得出该生物在体内表达任何 具体蛋白的结论，更遑论得出在对人或其他动物受试者的感染过程中表达所述蛋白的结论 了。同样，阐明结核分枝杆菌基因组的开放阅读框也不表明由该细菌编码或实际表达的任 何特定蛋白包含任何免疫显性(immune dominant) B细胞表位或T细胞表位，其为制备诊断 性、预后性和治疗性免疫试剂所需。举例而言，要得出结核分枝杆菌的具体蛋白或来源于该 蛋白的肽片段在免疫测定法形式下具有作为诊断试剂的效力，或适用于疫苗制备物中的结 论，必需显示该蛋白在所述细菌的感染循环中表达，且宿主生物对该蛋白和/或包含B细胞 表位或T细胞表位的肽片段(例如，CDS+-限制性CTL表位)进行免疫应答。结核分枝杆菌在培养中生长的能力提供了方便的模型以供在体外鉴定表达的结 核病蛋白。然而，培养环境与在体内发现结核分枝杆菌的人巨噬细胞、肺或肺外位点的环境 迥然有异。近来证据表明胞内寄生物(如，例如结核分枝杆菌)的蛋白表达概貌根据环境 信号显著变动，从而使得所述生物体外的表达概貌可能并不准确地反映其在自然位置(in situ)的表达概貌。结核分枝杆菌感染，或潜在性感染的重激活，诱导宿主反应，其包括将单核细胞 和巨噬细胞募集(recruitment)至感染位点。随着更多免疫细胞的积聚，形成肉芽肿 (granulomata)的结，其包含免疫细胞和由巨噬细胞的细胞毒性产物摧毁的宿主组织。随着 疾病的进展，巨噬细胞的酶造成蛋白、脂质和核酸的水解，导致周围组织的液化和肉芽肿的 形成。最终，该损伤(lesion)破裂，而杆菌释放至周围的肺、血液或淋巴系统中。在该感染循环中，杆菌暴露于四种不同的宿主环境，即肺泡巨噬细胞(alveoli macrophage)、干酪样肉芽肿(caseous granuloma)、胞外的肺部和肺外位点，例如肾或腹膜 腔、淋巴、骨或脊柱。认为杆菌可在所有这些环境中复制至不同的程度，然而，对于在每个位点的环境 条件所知甚少。所有四种宿主环境迥然有别，表明在每种环境下结核分枝杆菌的表达概貌 并不相同。相应地，从对数期的培养物中鉴定结核分枝杆菌蛋白并不一定表明在体内的各种 环境中何种蛋白被表达或具高免疫原性。类似地，在体外生长的巨噬细胞中鉴定结核分枝 杆菌蛋白并不一定表明其类似于结核分枝杆菌在干酪样肉芽肿、高度充气的肺部或具有低 氧气含量的肺外位置处的蛋白表达概貌。此外，结核分枝杆菌在宿主内的感染可视为动态过程，其中宿主免疫系统持续地 尝试包裹(encapsulate)杆菌并通过破坏受感染的巨噬细胞来摧毁杆菌。因此，结核分枝 杆菌经历胞内生长、破坏(此时胞内和分泌的细菌蛋白遭暴露和摧毁)和快速胞外繁殖的 循环。宿主和病原体的相互作用是多种因素的结果，其无法在体外复制。相应地，在本专利技术之前，并不清楚何种结核分枝杆菌蛋白在体内任何具体环境中 为最高度表达的和/或最具免疫活性或免疫原性的结核分枝杆菌蛋白。显然，仍有对快速并划算地用于确定由结核分枝杆菌造成的感染和/或与之相关 的疾病状况的诊断和预后试剂的需要。分子生物学、微生物学、蛋白组学、病毒学、重组DNA技术、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术描述于，例如下述文献1.Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York，第二版(1989)，第 I，II 和 III 卷全文；2. DNA Cloning :A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed. ，1985)， IRL Press, Oxford，全文；3.Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(M. J. Gait IS,1984)IRL Press, Oxford,全文，且特别是其中 Gait，ppl-22 ；Atkinson 等，p本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌的分离的或重组的免疫原性蛋白，其为推定的乙酮醇酸还原异构酶（下文中称作“ＫＡＲＩ”），或其免疫原性肽或免疫原性片段或表位。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊恩·加思韦特，
申请(专利权)人：泰里安诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：AU
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