本发明专利技术涉及微生物领域，具体公开了一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用。该制备方法将如SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220::E，接着扩增重组质粒pBV220::E，扩增产物连接到质粒pBBR1MCS-2中，然后转化到布鲁氏菌中，将重组菌株在25-30℃进行繁殖培养至其OD600值为0.8-1.2后升温至37-45℃进行诱导培养至其OD600值稳定，然后离心收集菌体，洗涤后用高渗溶液冻融即得。本发明专利技术采用生物技术将温控调节序列和裂解基因E的融合序列转化到布鲁氏菌中，制备成安全性高、保护效果好的菌壳，对控制布鲁氏菌病的流行和传播具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用。
技术介绍
布鲁氏菌(Brucella spp.)是一种胞内寄生、人兽共患病原菌，而布鲁氏菌病(布病)是指由布鲁氏菌引起的一种流行广泛、传染性强、危害极大、感染后难以根治的人兽共患传染病。动物布病主要症状为发热、流产、不育、慢性关节炎及神经损害等，能引起怀孕的雌性动物在怀孕后期流产，以及雄性动物的睾丸炎和附睾炎等；人布病主要通过皮肤粘膜、 消化道和呼吸道感染，其临床表现为长期发热，伴有多汗、关节痛、肝脾肿大以及生殖系统损伤等。人感染布鲁氏菌后，需要长时间的抗生素治疗，而且往往会留下较严重的后遗症。感染的家畜是人布病的主要传染源，人主要通过接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感染布病。布病不仅严重危害着人类和动物健康，同时影响畜牧业、旅游业、国际贸易及经济发展。该病在世界各地都有广泛流行，每年因此造成的经济损失高达数十亿美元。 布病在我国流行范围广、危害严重，自新中国成立后开展了全面而系统的防治，有效地控制了布病的发生和流行。然而，从上世纪90年代以来，我国人与动物布病的发病率又有明显上升的趋势。当前使用的布鲁氏菌疫苗多为弱毒疫苗，这类疫苗虽然具有一定的免疫保护效果，但也具有非常明显的缺点，即毒性大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。因此研制一种具有良好保护效果和安全性的布鲁氏菌疫苗具有重要的实际意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用，使所述布鲁氏菌菌壳具有良好的安全性和保护效果，优于现有弱毒疫苗。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案一种布鲁氏菌菌壳的制备方法，包括步骤1、将如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到质粒pBV220中， 得到重组质粒PBV220: :E ；步骤2、用如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列的反向引物BRU2扩增重组质粒pBV220::E，将扩增后的产物连接到质粒 pBBRlMCS-2中SpeI和Mil酶切位点之间，得到重组质粒pBBRlMCS_2_E ；步骤3、重组质粒PBBR1MCS-2-E转化到布鲁氏菌菌株中得到重组菌株，将重组菌株在25-30°C进行繁殖培养至其OD6tltl值为1. 0后迅速升温至37-45°C进行诱导培养至其 OD600值稳定，然后离心收集菌体，洗涤后用高渗溶液冻融即得。菌壳(Bacterial ghosts, BG)是一种新型细菌疫苗，通常是由PhiX174噬菌体的裂解蛋白E在细菌表面形成跨膜孔状结构。噬菌体Η Χ174的E基因编码一个由91个氨基酸组成的疏水性蛋白质，该蛋白可通过寡聚化起到连接细菌内、外膜的作用，从而形成一种孔状通道，孔状通道的直径介于40-200nm之间，其大小因细菌个体差异而不同，主要涉及细菌自溶发生的程度、肽聚糖层上筛孔的大小情况以及裂解过程中细胞膜所发生的变化。 孔状通道一旦形成，在细胞内高渗透压的作用下，细菌内容物通过孔道排出，从而形成一个没有核酸、核糖体和其他胞内成分的细菌空壳。菌壳是以非变性方法制备而成，完好地保留了细菌菌体和各种抗原结构，保持了细菌天然的外膜和天然表面抗原，外膜上有高免疫刺激性的脂多糖和肽聚糖等结构，这些细胞表面的有效成分可以被巨噬细胞或抗原递呈细胞所识别，进而激发有效的免疫反应过程。此外，菌壳自身还具有佐剂活性，经改造后可以作为疫苗载体。因此，本专利技术采用合适的引物、质粒等，通过克隆、重组、转化等生物技术手段制备布鲁氏菌菌壳，由于布鲁氏菌内细胞内容物已经外泄，属于灭活疫苗，所以其安全性明显高于现有的弱毒疫苗。其中，本专利技术所述布鲁氏菌优选为布鲁氏菌S2菌株(即猪种S2株)、布鲁氏菌M5 菌株(即羊种M5株)、布鲁氏菌RB51菌株(即牛种RB51株)或布鲁氏菌104M菌株(即人用104M株)。在本专利技术所述制备方法中，质粒PBV220为市售商品质粒，其上带有温控调节序列ApL/pR-cI857以及确定的多克隆位点，本专利技术通过定向克隆将如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到温控调节序列XpL/pR-cI857的下游，得到重组质粒 PBV220: :E,以便在后续布鲁氏菌菌壳的制备过程中通过控制温度来控制所述裂解基因E 的表达。其中，步骤1所述裂解基因E由以下方法制备用如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的正向引物LE-F和如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的反向引物LE-R从噬菌体Η Χ174中扩增得到裂解基因E。由于质粒pBV220不能在布鲁氏菌中复制，故本专利技术用如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的正向引物BRUl和如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的反向引物BRU2扩增重组质粒 PBV220: :E中的λ pL/pR-cI857和裂解基因E的融合序列，并将扩增后的产物连接到广宿主质粒载体pBBRlMCS-2中SpeI和Mil酶切位点之间，将重组质粒pBBRlMCS-2-E转化到布鲁氏菌菌株中，进而通过温控让裂解基因E在布鲁氏菌中表达。质粒PBBR1MCS-2由美国路易斯安那州立大学医学中心Kovach教授惠赠， pBBRlMCS-2图谱参见图1,序列见SEQ ID NO :6。为了能够很好地收集布鲁氏菌菌壳，本专利技术先将重组菌株在25-30°C进行繁殖培养，由于有温控序列的存在，在30°C以下裂解基因E是不会表达的，确保布鲁氏菌菌株能够繁殖到其0D_值为0. 8-1. 2，优选为1. 0，使菌体量达到合适的程度，过高的菌体量易使之后的裂解不充分，造成大量活菌的存在，影响安全性；而过低的菌体量不容易收集到足够的裂解后的菌壳。在繁殖培养后迅速升温至37-45°C进行诱导培养至其0D_值稳定，温控系统在 37°C以上就不会阻遏裂解基因E的表达，因此大量的裂解蛋白E被表达出来，对布鲁氏菌菌株进行裂解，形成菌壳，在裂解过程中布鲁氏菌菌株的OD6tltl值是不断下降的，当其值稳定时即完成裂解，裂解时间因不同布鲁氏菌菌株而异，一般在2天左右。在完成裂解后，通常99. 9%以上的布鲁氏菌菌株均会裂解形成菌壳，但由于现有技术的限制很难达到100%的裂解，因此为了进一步确保菌壳的安全性，本专利技术将菌壳，即离心收集到的菌体洗涤后用高渗溶液冻融，确保灭活残存的活菌。在本专利技术所述制备方法中，步骤3所述转化优选为电转化，所述繁殖培养温度为 ^°C，所述诱导培养温度为42°C，所述高渗溶液为5%氯化钠溶液。此外，本专利技术还提供一种由本专利技术所述制备方法制备的布鲁氏菌菌壳以及所述布鲁氏菌菌壳在制备预防布鲁氏菌病的疫苗中的应用。本专利技术所述疫苗包括有效量的所述布鲁氏菌菌壳和医药学上可接受载体。其中， 医学上可接受载体为本领域公知的用于制备疫苗的常用载体，还可包括免疫增强剂或免疫调节剂，例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等公知的药剂。由本专利技术所述制备方法制备的布鲁氏菌菌壳，通过形态学观察，具有典型的菌壳特征，有效的保留了其外膜结构，大部分的胞内物质被释放。经BALB/c小鼠进行的安全性和免疫试验证实，本专利技术所述布鲁氏菌菌壳副作用小、安全性高，可诱导小鼠产生保护性抗体，与弱毒活疫苗相比较，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种布鲁氏菌菌壳的制备方法，其特征在于，包括：步骤１、将如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示核苷酸序列的裂解基因Ｅ克隆到质粒ｐＢＶ２２０中，得到重组质粒ｐＢＶ２２０：：Ｅ；步骤２、用如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示核苷酸序列的正向引物ＢＲＵ１和如ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３所示核苷酸序列的反向引物ＢＲＵ２扩增重组质粒ｐＢＶ２２０：：Ｅ，将扩增后的产物连接到质粒ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２中ＳｐｅＩ和ＳａｌＩ酶切位点之间，得到重组质粒ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２－Ｅ；步骤３、重组质粒ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２－Ｅ转化到布鲁氏菌菌株中得到重组菌株，将重组菌株在２５－３０℃进行繁殖培养至其ＯＤ６００值为０．８－１．２后迅速升温至３７－４５℃进行诱导培养至其ＯＤ６００值稳定，然后离心收集菌体，洗涤后用高渗溶液冻融即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，刘爽，冯书章，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82
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