本发明专利技术介绍了一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用，其基因组中整合了带有乳酸杆菌信号肽的AY220075枯草芽孢杆菌的中性植酸酶基因，所扩增的序列是1-1152bp碱基；信号肽基因是Z14250的260-349位碱基；将中性植酸酶基因和信号肽基因连接后插入到多克隆位点，并整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中。本发明专利技术的重组乳酸杆菌作为饲料添加剂用于养猪业，可弥补猪肠道不能分泌植酸酶的不足，可促进饲料原料中的植酸磷的代谢，减少无机磷的排放，有利于保护环境。宿主菌乳酸杆菌对动物机体也有益生功能，在猪、禽等单胃动物生产中具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因重组技术，特别是一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用。
技术介绍
植酸8|(戸1^1已86)艮|]肌醇六憐酸水角军8|(1^0_土1108土101 hexaphosphate phosphor -hydrotase)，是催化植酸(即肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。植酸的化学名称是环己六醇六磷酸酯。分子式为C6H18024P6，构式为C6H6 6，它是一种淡黄色或黄褐色的黏稠液体。易溶于水、乙醇、丙酮，几乎不溶于苯、氯仿、醚和己烷。而植酸本身虽然毒性很小，但却有很强的螯合能力，因此具有抗营养作用。它在动物胃肠道中会与多种金属离子如Si2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等离子螯合并能与蛋白质等形成相应的不溶性复合物(姚斌，范云六.植酸酶的分子生物学与基因工程.生物工程学报，2000，16:1 5.)。植酸广泛存在于各种植物中，在植物性饲料中的磷主要以植酸及其盐形式存在，由于畜禽饲粮中植物性饲料所占比例较大，含植酸磷较高，尤其是油粕、 糠麸等含有较高比例的植酸磷，所以研究如何降解饲料中的植酸磷具重要的实践意义。一般来讲，自然界的植酸酶来源有三种植物的籽实、微生物和动物的胃肠道。动物胃肠道中的植酸酶来自于肠道微生物区系和肠粘膜分泌的内源性植酸酶。有研究表明， 单胃动物肠道黏膜中的内源性植酸酶及肠道微生物产生的植酸酶活性很差，反刍动物瘤胃微生物产生的植酸酶能有效水解植酸盐。因此，反刍动物不用考虑植酸磷的利用问题。植物来源的植酸酶主要来源于植物籽实和植物组织。这些酶的活性较高，但相互之间由于植物来源的不同其活性也有差异。许多研究证明，植物来源的植酸酶不适宜在动物饲料中应用，因为植物来源植酸酶的最佳PH值为5. 5，不适合单胃动物胃内的酸性环境。微生物来源的植酸酶是目前植酸酶研究的重点，因为微生物植酸酶的PH值范围较大，比较接近单胃动物的胃肠生理条件。目前用于工业生产植酸酶的微生物主要是曲霉，如无花果曲霉和黑曲霉。真菌的酸性植酸酶主要适用于PH值呈酸性的单胃动物及少数鱼类如虹鳟等，但不适用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及不能在单胃动物PH值呈中性的肠道中表现酶活力，限制了酸性植酸酶的应用范围。因此，研究PH范围大的中性植酸酶成为当代植酸酶研究的热点ο磷是动物必需的一种常量矿物元素，在参与体内正常的新陈代谢中起着重要作用，而且是骨骼的必要成分。畜禽必须从饲料中摄取足够的磷才能维持正常的生命和生产活动，特别是对营养十分敏感的高产动物。磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。在谷物、豆类和油料作物等的籽实中，磷的基本贮存形式是植酸磷，占植物中总磷的60%-80%，但其难以被单胃动物利用，从而造成很大问题首先是磷资源的浪费 (Ehrlich KCj Montalbano B Gj Mullaney E Jj et al. Identification and cloning of a second phytase gene (phyB) from Aspergillus niger (ficuum) . Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993，195:53 57.)。一方面饲料中的磷不能得到有效利用；另一方面为了满足动物的营养需求，又必须在饲料中添加无机磷，提高饲料成本；其次是形成高磷粪便污染环境。饲料中85%左右的植酸磷会被动物直接排出体外，造成水和土壤的严重污染。植酸酶作为一种新型饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Pandey A, Szakacs Gj Soccol C， Rodriguez-Leon Jj Soccol V. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technolj 2001， 77:203 214.)。植酸酶能够分解饲料中的植酸，形成畜禽可利用的磷酸和肌醇单磷酸至肌醇五磷酸，它能使饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%(马俊孝.饲用植酸酶的研究进展.饲料工业，2010，31 (16):26 30.)，从而减少植物性饲料中无机磷的添加量，减轻磷污染，缓解磷资源缺乏。同时解除植酸的抗营养作用、提高饲料的营养价值，还可以增加动物对矿物质的利用率，提高碳水化合物的吸收率，促进动物的生长发育。 因此在饲料中添加植酸酶对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要的意义，有着广泛的应用前景。目前克隆到的植酸酶基因主要有真菌来源的PhyA和phyB基因，芽孢杆菌来源的phyC (L)基因，大肠杆菌来源的appA基因，其它微生物来源及动物来源的植酸酶基因(Pandey A, Szakacs G, Soccol C, Rodriguez-Leon J, Soccol V. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technol, 2001, 77:203 214.)。1907年，Suzuki在米糠中首次发现植酸酶。对植酸酶基因研究较多的是来源于真菌的PhyA(B)基因，其表达产物几乎为酸性植酸酶，是组氨酸酸性磷酸酶家族。最先分离出的植酸酶基因是Aspergillus ficuum NRRL31!35 的phyA基因(Van Hartingsveldt W, van Zeijl C M J, Harteveld M G, et al. Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger . Gene, 1993(127) :87 94.) (Van Hartingsveldt, 1993)，该基因全长 1506bp，其中 +46 +147 的长为102bp的核苷酸序列是典型的真菌内含子序列。它的基因编码467个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+19位的 Gly之后。同年，Ehrlich等分离克隆了来自A. ficuum的第二个植酸酶基因phyB，phyB和 PhyA的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性低，phyB基因全长16(^bp，共编码479个氨基酸，其上至少有8个糖基化位点，phyB编码的植酸酶最适pH值为2. 5，而phyA植酸酶的最适PH值为5.0。1998 年，Kerovuo 等(Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen Petal. Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis · Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(6) :2079 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种转芽孢杆菌源ａ－淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是：该转芽孢杆菌源ａ－淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将ａ－淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体ｐＩｌａｃ的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌Ｌ．ＣＥＣＴ５２７６的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α－淀粉酶基因来源于ＧｅｎＢａｎｋ上的登陆号为ＧＵ５９１６５８的淀粉液化芽孢杆菌，所用于扩增的序列是１－１５４５ｂｐ位碱基；信号肽基因来源于在ＧｅｎＢａｎｋ上的登陆号为Ｚ１４２５０的短小乳酸杆菌Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ１．２０２８ ，所用于扩增的序列是２６０－３４９ｂｐ位的碱基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁轲，赵振升，钟社普，王国永，余祖华，白东英，周变华，孔涛，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：41
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