一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535/Pcda-GFP及其构建方法技术

本发明专利技术公开一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella?typhimurium)TA1535/Pcda-GFP及其构建方法。该沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella?typhimurium)TA1535/Pcda-GFP，其保藏编号为：CCTCC?NO：M?2011269。本发明专利技术将带有强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组质粒转入到沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535中，由此而获得转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella?typhimurium)TA1535。该工程菌株相比于野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535，其荧光强度大大增强，从而当其用于毒性测试时候，能提高毒性测试方法的灵敏度，能够更方便、更快速的检测毒性物质。因此本发明专利技术的实现为更为方便、快速、灵敏的检测毒性物质提供了便利，可在环境中遗传物质的检测中进行推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535/ Pcda-GFP工程菌株及其构建方法。
技术介绍
传统的毒性试验方法如鱼类试验、藻类实验、浮游动物试验等，或费用相对昂贵， 或操作繁琐试验耗时较长，不利于快速检测或在线监测。而发光细菌法则能很好的克服这些缺陷，它具有快速、灵敏和操作简单等优点。应用发光细菌进行毒性测试可以有以下几个方面一个是利用天然发光细菌进行毒性测试，细菌发光强度与毒性物质浓度成负相关关系(称为light-off)，以发光抑制率反映综合毒性大小，这种方法已被广泛接受；应用重组 DNA技术构建重组发光细菌(Recombinant Luminescent Bacteria)，分为组成型和诱导型两种，其中诱导型须在特定的诱导物存在时荧光酶才得以表达，在毒物亚致死浓度范围内， 其剂量效应关系为正相关关系(表现为light-on)；还有就是利用从发光生物体中提取出来得酶系统进行毒性试验。传统的发光细菌法只能给出样品的综合毒性，而成分越趋复杂的城市污水和工业废水要求日常环境监测中不仅要反映水体总毒性大小，更要提供不同类型毒性物质的信息。于是重组发光细菌开始进入人们的视野。Iux操纵子作为编码和调控细菌生物发光的基因，其表达的直接结果非常直观并且便于仪器检测，因此在分子生物学研究中被广泛地用作报告基因以研究基因的表达与调控。基于Iux报告基因这些特点，于上世纪90年代就开始有学者提出构建重组发光细菌来检测环境中特定毒性物质的方法。重组发光细菌和天然发光细菌相比，其优势在于不同的调节基因和启动子赋予了 RLB不同的识别能力，能够根据毒性作用机制特异性的识别各类毒性物质，故可用以检测各种细胞损伤，或是检测环境中某类特殊化合物如环境内分泌干扰物(EDCs)、持久性有机污染物(POPs)等。近十几年，随着人们对RLB的关注，越来越多各种具有不同功能的RLB被创造出来。SOS/Umu测试系统正是基于DNA损伤物诱导SOS反应而表达umuC基因的能力，在鼠伤寒沙门菌&ilmonella typhimuriumTA1535中导入携带umuC”LacZ嵌合体的质粒pSK1002，该质粒携带umu操纵子、umuD基因和umuC”LacZ融合基因的启动子及四环素和氯霉素耐药基因，允许通过药物选择转化株，新构建的细菌称为S. typhimurium TA1535-pSK1002〃当细菌受诱变物作用引起SOS反应时，激活umuC-LacZ融合基因，表达出有β -半乳糖苷酶活性的融合蛋白，通过检测此酶的活性可以确定受试物引起DNA损伤的程度，若加入S9混合液，则可以检测化学物是否代谢活化生成损害DNA的产物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更方便、灵敏、快速的监测毒性物质的转基因沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda_GFP工程菌株及其构建方法。本专利技术的转基因沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium) TA1535/Pcda-GFP 于2011年07月沈日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011269o本专利技术的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium) TA1535/Pcda_GFP是通过以下方法构建的，包括以下步骤将强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP连接，再与表达载体pET20b(+)连接构建成重组质粒PSK-EGFP，再转化到沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium) TA1535 中，从而得到转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium) TA1535/Pcda_GFP，所述的强启动子Pcda的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的98位-219位所示，所述的绿色荧光蛋白基因EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的220位-936位所示。本专利技术使用的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535属于现有技术中的菌株，可以从德国DSMZ菌种保藏中心购买到。本专利技术将带有强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组质粒转入到沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535中，由此而获得转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(SalmonelIa typhimurium) TA1535。该工程菌株相比于野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535，其荧光强度大大增强，从而当其用于毒性测试时候，能提高毒性测试方法的灵敏度，能够更方便、更快速的检测毒性物质。因此本专利技术的实现为更为方便、快速、灵敏的检测毒性物质提供了便利，可在环境中遗传物质的检测中进行推广应用。本专利技术的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonellatyphimurium)TA15!35/Pcda-GFP 于 2011年07月沈日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学， 其保藏编号为CCTCC NO =M 2011269o附图说明图1是强启动子Pcda PCR扩增鉴定结果，M :DL2000DNA Marker, Pcda =Pcda扩增产物，2、阴性对照；图2是绿色荧光蛋白基因EGFP PCR扩增鉴定结果，M :DL5000DNAMarker, EGFP, EGFP扩增产物，2、阴性对照；图3是Pcda-EGFP连接后的PCR扩增鉴定结果，M :DL2000DNAMarker, 1、2、阴性对照，3、4、Pcda-EGFP连接产物；图4是白斑纯培养图；图5是白斑纯培养紫外激发图，激发光波长为365nm ；图6是野生型的沙门氏伤寒杆菌TA1535(1和2)和转基因沙门氏伤寒杆菌 TA1535/Pcda-GFP(阳1和阳2)工程菌株的紫外激发图，激发光波长为365nm。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1 一、强启动子Pcda的扩增以上海生工生物工程技术服务有限公司提供的含有Pcda启动子的质粒(货物名称为Pcda)为模板，分别以Cl和C2为上下游引物，PCR反应体系为(Pcda启动子质粒 IOOng, 1 μ L ；C150 μ Μ，1 μ L ；C250 μ Μ，1 μ L ；dNTP (IOmM) 1 μ L ；Taq 酶 5—10U，1 μ L ；低盐缓冲液，5yL;去离子水，45yL)，进行 PCR 反应(95 °C 4min,95°C 45s, 52 °C 30s, 72 °C 30s, 29cycle,72°C 10min,22°C forever)，PCR产物用1 %的琼脂糖电泳，显示所扩增的片段大小为120bp左右(图1)，和文献报道相符，结果符合预期。Cl:N 5' -AGCGAATTCGGGTTGACAGGATTTACG-3‘C2 =C 5' -TTCTCCTTTACTCATGCAAACACCT-3‘二、绿色荧光蛋白基因EGFP的扩增以含有绿色荧光蛋白基因EGFP的质粒(上海雅吉生物科技有限公司，货号 YJ-2194P)为模板，分别以Pl和P2为上下游引物，PCR反应体系为(EGFP质粒，IyL; P150 μ M，1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．沙门氏鼠伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ１５３５／Ｐｃｄａ－ＧＦＰ，其保藏编号为：ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ　２０１１２６９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张国霞，张家强，孙国萍，许玫英，蒋雍君，郭诗韵，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，佛山市环保技术与装备研发专业中心，
类型：发明
国别省市：81