高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia?coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.5048。本发明专利技术还公开了上述基因工程菌的构建方法及其应用。本发明专利技术首次将谷氨酸棒杆菌ATCC13032中三磷酸胞苷合成酶基因pyrG在大肠杆菌Rosetta中高效表达。重组的基因工程菌株能够高效表达三磷酸胞苷合成酶基因pyrG，分泌表达三磷酸胞苷合成酶，IPTG诱导表达重组大肠杆菌，酶活为10U/mg；乳糖自诱导表达重组大肠杆菌，酶活为7U/mg。

【技术实现步骤摘要】

本发 明属于生物工程
，具体涉及一种。
技术介绍
胞嘧啶核苷三磷酸(简称CTP)在体内参与磷脂类(卵磷脂、脑磷脂、丝氨酸磷脂、 鞘磷脂等)的生物合成过程。磷脂类是神经组织的重要成分，也是一种天然的脂肪乳化剂。 具有健全大脑和神经组织，增强智力和记忆力并有促进体内胆固醇、脂肪的运输从而防止堆积的作用。临床上，CTP作为生化药物用于治疗脑外伤，神经损伤所致的意识障碍。对脑震荡、神经官能症、神经损伤所致的意识障碍、脂肪肝等有显著疗效，另外在治疗脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全等方面也有良好的效果。CTP合成主要有化学合成法、光合磷酸法、生物合成法三种。由于化学法合成所用试剂多、工艺复杂、条件要求高、反应时间长等缺点，不大容易实现大规模的工业化生产。随着生物技术的快速发展，CTP的合成从化学方法转入了酶转化研究。酶法即以三磷酸胞苷合成酶为酶源催化生产CTP。三磷酸胞苷合成酶 (E. C. 6. 3. 4. 2)在谷氨酰胺、ATP、GTP、Mg2+参与下，可催化UTP生成CTP、ADP和Pi，是CTP 生物合成的关键酶。因此，利用基因工程手段，克隆高活性的三磷酸胞苷合成酶基因，构建工程菌株大量表达三磷酸胞苷合成酶，以UTP为原料一步生产CTP，是CTP高效合成的一条可行途径。此途径具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，能实现CTP生产过程的节能、降耗、减排。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌在高效表达三磷酸胞苷合成酶中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，该菌株已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编:100101，保藏编号为 CGMCC No. 5048。上述高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，它是包含三磷酸胞苷合成酶PyrG基因的大肠杆菌，所述三磷酸胞苷合成酶pyrG基因来源于谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。其中，所述的三磷酸胞苷合成酶pyrG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，基因长度为1665bp，其编码554个氨基酸和一个终止密码子，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌的构建方法，通过聚合酶链式反应从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中提取三磷酸胞苷合成酶 pyrG基因，构建重组表达质粒载体pET28a-pyrG，将重组质粒热击转化大肠杆菌Rosetta， 然后进行诱导表达，筛选得到一株产酶量最高的菌株CGMCC No. 5048。上述高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌在高效表达三磷酸胞苷合成酶中的应用。通过培养上述基因工程菌，利用IPTG或乳糖诱导基因工程菌中三磷酸胞苷合成酶基因PyrG的表达，收集菌体，超声破碎细胞，得到的上清作为粗酶液。 有益效果本专利技术首次将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032中三磷酸胞苷合成酶基因pyrG在大肠杆菌Rosetta中高效表达。重组的基因工程菌株能够高效表达三磷酸胞苷合成酶基因pyrG，分泌表达三磷酸胞苷合成酶，IPTG诱导表达重组大肠杆菌，酶活为10U/mg ；乳糖自诱导表达重组大肠杆菌，酶活为7U/mg。附图说明书图1为本专利技术的质粒构建图。图2为以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR后的电泳图。其中，第1道:maker2000， 第 10、11、12、13 道:ATCC13032pyrGo具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1 三磷酸胞苷合成酶基因pyrG的克隆。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterinm glutamicum)ATCC13032由本实验室保藏，培养基组成(g. L-1)如下酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，补蒸馏水至1L。将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032接种于30mL培养基中，37°C培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组。构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下上游引物5’ CGGGATCCATGACCTCTAGTCGAAAAGTCCG3’5， GGAATTCCATATGATGACCTCTAGTCGAAAAGTCC3，下游引物(CRII-anti含 Hind III)为5’ GGAATTCCTAAGGGTGGACACGCAGCTCC3’5’ CCCAAGCTTCTAAGGGTGGACACGCAG3’所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。基因的PCR条件94°C变性5min，按如下参数循环30次94°C变性lmin，60°C退火50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 IOmin凝胶电泳分离纯化PCR产物(图1)并进行胶回收。将胶回收产物连接到 PMD18-SimpleT-Vector,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37°C， 220rpm下培养8-12小时。利用上海申能博彩有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，并将菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。序列长度为1665bp，如SEQ ID No:l所示。实施例2 基因pyrG表达载体的构建。根据获得的pyrG基因的核苷酸序列(如SEQ ID No:l所示)设计表达引物，在引物的5，端和3，端分别引入NdeI和HindIII酶切位点，PCR扩增，连接PMD18-Simple T-vector，构建 PMD 18T_pyrG 重组质粒。采用 NdeI 和 HindIII 双酶切 PMD 18T_pyrG 重组质粒和pET28a质粒，连接酶切产物，获得重组质粒pET28a-pyrG， 转化大肠杆菌DH5a。挑取单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37°C，220rpm下培养8_12小时。 提取质粒，经PCR和双酶切筛选获得含有pyrG基因的重组表达质粒，并测序确认重组质粒的阅读框正确。实施例3 表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032pyrG基因的大肠杆菌工程菌株的构建及蹄选。将获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，挑取单菌落，接种5mL含有氯霉素和卡拉霉素的LB液体培养基中，370C，220rpm下培养12小时。提取质粒，以质粒为模板，PCR验证。实施例4 =IPTG诱导表达重组大肠杆菌。挑取重组菌大肠杆菌Rose本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高效表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ），该菌株已于２０１１年７月８日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．５０４８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，王艳，谢婧婧，陈勇，许琳，柏建新，陈晓春，吴菁岚，赵小迪，李楠，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84