利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体技术方案

本发明专利技术公开了一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体。该载体是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。该方法包括将秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白的编码基因插入该专用表达载体中，再转化入大肠杆菌原核表达系统并诱导表达，将表达功能蛋白的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失秀丽线虫或野生型株系秀丽线虫，通过秀丽线虫表型筛选和功能蛋白调控因子表达水平检测进行蛋白拯救功能验证。本发明专利技术具有十分广泛的应用前景，有望成为重组蛋白类药物筛选的重要技术手段，同时也是进行蛋白质功能研究的重要技术之一。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术产品应用领域中蛋白拯救的方法，特别是涉及一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体。
技术介绍
秀丽线虫作为第一个完成全基因组序列测定的多细胞真核模式生物，因其细胞数量明确、遗传背景清楚、基因组小及易于操作等优点已广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学和分子生物学等多个研究领域(Greer et al. Members of the H3K4trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature. 2010 Jul 15,466(7304) :383_7)。基于秀丽线虫平台规模化筛选其体内功能性蛋白的作用已成为目前研究的热点。传统基因水平上的显微注射和RNA干涉虽能到达研究秀丽线虫体内功能蛋白的作用，但由于其存在操作繁琐、成本高、周期长及破坏性大等缺点，更甚至于会出现功能蛋白不表达的现象，使秀丽线虫体内重要功能蛋白的研究及相应表型的筛选受到了极大限制(Rieckher et al. Transgenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol.2009,561 21~39 ；Shyu et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 2008,3(4) :588_96.)。自然条件下秀丽线虫体内功能蛋白不表达主要是由于其体内基因突变和/或基因缺失导致的，基于这类基因异常的秀丽线虫的研究结果不可靠，而基于蛋白水平针对秀丽线虫本身的修复研究尚未展开。
技术实现思路
专利技术人在长期从事秀丽线虫体内功能蛋白的原核表达研究中发现，通过直接喂饲体外高效表达秀丽线虫体内功能蛋白的大肠杆菌不仅可以实现其突变株系表型的回复， 而且可改变其因基因突变导致的蛋白功能缺失，进而达到蛋白拯救(protein rescue)的目的。本专利技术的目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的专用表达载体。本专利技术所提供的专用表达载体，是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。所述蛋白转导肽可为TAT、Antp, VP22、Poly(Arg)和/或Poly (Lys)等，优选为 TAT。用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体， 如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，优选为 pET28。本专利技术的第二个目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法。本专利技术所提供的利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法，是将秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白的编码基因插入权利要求1或2或3所述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统并诱导表达，将得到的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失秀丽线虫或野生型株系秀丽线虫而实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救。可包 括以下具体步骤1)筛选秀丽线虫体内表型明显的功能蛋白并克隆其编码基因；2)将功能蛋白编码基因插入上述专用表达载体中，得到含有蛋白转导肽编码区和功能蛋白编码基因相融合的原核表达载体；3)将步骤2)构建的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统；4)原核表达载体的诱导表达及蛋白表达水平检测；5)将表达功能蛋白的重组大肠杆菌喂饲功能蛋白缺失的秀丽线虫；6)秀丽线虫表型筛选和功能蛋白调控因子表达水平检测。在上述利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法中，所述步骤3)中大肠杆菌原核表达系统的宿主菌可为BL21、DH5 α、HBlOl、JM109、0Ρ50或耐辐射奇球菌等。上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。所述步骤4)中可采用化学试剂诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达， 其中，化学试剂诱导表达条件可为采用500mL摇瓶发酵(150mL/瓶)；诱导剂IPTG诱导表达(终浓度ImM)；诱导表达的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；诱导表达时间6_8小时。所述步骤4)中还可采用温度诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，温度诱导表达条件可为采用500mL摇瓶30°C发酵(150mL/瓶)；诱导表达的0D_ = 0. 4-0. 6 ；诱导表达温度42°C -44°C ；诱导表达时间6_8小时。此外，所述步骤4)中的蛋白表达水平检测可采用SDS-PAGE和/或免疫印迹法。所述步骤5)中喂饲秀丽线虫的大肠杆菌是步骤4)中鉴定表达功能蛋白的菌株且预先涂布到NGM平皿或LB平皿中。所述步骤6)中秀丽线虫表型筛选是指筛选出具有功能蛋白表型的秀丽线虫，具体包括形态结构变化和细胞水平变化等，如是否出现体型变小或肥胖、是否出现空泡现象、 是否出现运动行为失调等；功能蛋白调控因子包括蛋白质，DNA和RNA等，其表达水平筛选可以为免疫印迹、凝胶迁移实验和聚合酶链式反应等。本专利技术结合蛋白转导域家族的研究，以及利用秀丽线虫的主要食物来源大肠杆菌为中介，提供了一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的方法及其专用表达载体。本专利技术所述蛋白拯救(protein rescue)是指通过给特定功能蛋白编码基因突变的秀丽线虫株系喂饲能够表达该功能蛋白的微生物如大肠杆菌，从而纠正秀丽线虫株系中该功能蛋白缺失表型的技术。本专利技术不仅能够克服常规基于模式生物秀丽线虫研究功能蛋白方法的缺陷，而且可以通过微生物如大肠杆菌直接转导体外高效表达的功能蛋白，避免了功能性基因不表达的现象，进而节约了特异功能蛋白筛查及大规模研究的成本等。同时，迄今为止未见利用蛋白转导肽的跨膜转导作用并依赖大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的研究报道。本专利技术提供的利用大肠杆菌原核表达系统从蛋白质角度拯救秀丽线虫体内功能蛋白的方法，具有十分广泛的应用前景，不仅可用于秀丽线虫体内功能蛋白的拯救研究和应用，而且还可用于其他物质例如果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等动物体内功能蛋白的拯救研究，因此有望成为重组蛋白类药物筛选的重要技术手段， 同时也将有可能成为蛋白质功能研究的重要技术之一。本专利技术利用秀丽线虫平台及原核表达体系首次提出了蛋白拯救的作用，为基于蛋白功能的研究及载体筛选提供重要的技术平台，具有重要的原创性和新颖性。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1 原核表达载体pET28b-Tat_EGFP和pET28b_EGFP的构建示意图。图 2 =SDS-PAGE 和 Western blot 检测 Tat-EGFP 和 EGFP 蛋白的表达。图3 荧光显微镜观察表达EGFP的菌体细胞的荧光信号。图4 荧光显微镜观察TAT-EGFP和EGFP蛋白荧光信号在秀丽线虫体内分布变化。图 5 原核表达载体 pET28-Tat-S0D-l，2，3，4，5本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白拯救的专用表达载体，是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张成岗，吴永红，叶巧，张晓，李伟光，高艳，石锦平，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11