利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用。本制剂（10%T11-W厚垣孢子颗粒剂）在施加有效孢子量为2×107时，防效达85.96%，高于10%T11-W分生孢子颗粒剂的防效（73.32%）。在施加有效孢子量为2×106时，本制剂的防效为68.96%，明显高于T11-W分生孢子颗粒剂的47.15%，且两者差异显著。表明T11-W厚垣孢子颗粒剂对根结线虫的防治效果明显优于其分生孢子颗粒剂。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物
，涉及利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用。本制剂（10%T11-W厚垣孢子颗粒剂）在施加有效孢子量为2×107时，防效达85.96%，高于10%T11-W分生孢子颗粒剂的防效（73.32%）。在施加有效孢子量为2×106时，本制剂的防效为68.96%，明显高于T11-W分生孢子颗粒剂的47.15%，且两者差异显著。表明T11-W厚垣孢子颗粒剂对根结线虫的防治效果明显优于其分生孢子颗粒剂。【专利说明】利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用。
技术介绍
木霉(Trichoderma spp)菌,广泛存在于土壤、植物残体、植物根围、植物叶片及种子、球茎表面及动物粪便上。该类真菌因能产生拮抗物质和寄生有害植物病原菌，而被人们广泛应用。(杨春平，张晋康，等。绿色木霉L24菌株分生孢子可湿性粉剂的研制。西北农业学报，2010，19(9):43-47)。目前生产上常用的木霉菌剂多为它的分生抱子制剂，如美国的ToPshield(哈茨木霉T-22)、以色列Trichodex (哈茨木霉T39)及中国的根友(哈茨木霉LTR-2)等。木霉Tll-W是从黄瓜根结线虫卵上分离所得，菌种保藏号CGMCC N0.7938，经鉴定是哈茨木霉。该菌是一种具有应用潜力的线虫生防真菌，不但能够寄生根结线虫(Meloidogyne spp.)卵和雌成虫，还能寄生秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)成虫，并能在其虫体上产生大量厚垣孢子。厚垣孢子是木霉抵抗逆境条件而产生的，人工发酵培养要求条件苛刻且产孢量低，因而国内外对其研究应用少。但厚垣抱子具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感等特点，因此，研究利用秀丽隐杆线虫生产木霉厚垣孢子方法，对研制以木霉厚垣孢子为主体的生防制剂具有重要意义。秀丽隐杆线虫，是一种模式线虫。它生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，生长周期短，从卵到成虫只需三天半(刘恩岐，仓林让。模型动物一秀丽隐杆线虫研究进展.动物科学与动物医学，2003，20 (10):23 — 25)，故能迅速大量繁殖，供Tll-W作培养基生产厚垣孢子。
技术实现思路
1.利用秀丽隐杆线虫培养Tll-W厚垣孢子本专利技术提供一种对根结线虫卵和秀丽隐杆线虫成虫有高效寄生率的菌株T11-W，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏，其保藏号为CGMCC N0.7938，保藏时间为2013年7月19日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。本专利技术并提供一种利用秀丽隐杆线虫培养木霉Tll-W厚垣孢子的方法。将秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌Tl1-W分生孢子共同加到0.8%琼脂培养基上，于20~25°C的环境，黑暗静止培养8~10天，即可收集厚垣孢子。2.Tll-W厚垣孢子制剂研究与应用本专利技术生产的Tll-W厚垣孢子在农业上的应用是防治土传的线虫病害，这决定了该菌剂的施药方式为浇施、撒施或穴施。综合考虑多方面因素选择以Tll-W厚垣孢子粉为有效成分配制一种颗粒剂，组分如下:厚垣孢子10重量份娃藻土70重量份4，47_二羟基二苯甲酮8重量份糊精10重量份将上述组分置适宜的容器内混合均匀，加入适量蒸馏水，并用醋酸和/氨水调节PH为6，制成“手捏成团，压之即散”的软材，再以挤压方式通过14~22目筛网(板)，制成均匀的颗粒。上述组分中硅藻土为吸附剂，4，4' -二羟基二苯甲酮为稳定剂，糊精为粘合剂，醋酸和氨水为PH调节剂，蒸馏水为润湿剂。上述颗粒剂的应用效果如下:对番茄根结线虫的防治(温室盆栽)表1本制剂对番茄根结线虫的防治效果【权利要求】1.利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在于将秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌Tll-W分生孢子共同加到0.8%琼脂培养基上，于20~25°C的环境，黑暗静止培养8~.10天，即可收集厚垣孢子。2.如权利要求1所述的培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在于秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌Tll-W分生孢子的用量比例为线虫800~1000条:分生孢子lX106cfu。3.如权利要求1所述的培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在所述秀丽隐杆线虫成虫的培养方法包括怀卵成虫的培养，其中包括E.coli 0P50的培养及菌体收集、线虫的平板培养、线虫的摇瓶大量培养；大量卵的制备；成虫的培养及收集各步骤；其中: 所说的E.coli 0P50的培养采用的培养基为固体LB培养基和液体LB培养基； 所说的线虫的平板培养采用的培养基为含有E.coli 0P50的改良NGM培养基，其配方为:氯化钠3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.llg，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，琼脂20g，水1000mL ； 添加色氨酸0.2g对秀丽隐杆线虫的生长发育有促进作用； 所说的线虫的摇瓶大量培养采用的培养基为含有E.coli 0P50的改良液体NGM培养基，其配方为:氯化钠3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.llg，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，水1000mL ；所说的大量卵的制备过程中，采用新鲜的改良bleach溶液进行反复洗涤； 改良Bleach溶液的配方为:6%NaC10 20 ml,NaOH lg，低温蛋白酶0.2g，水定容至100ml ； 所说的成虫的培养采用的培养基为含有E.coli 0P50的改良液体NGM I其配方为:氯化钠3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.llg，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾 0.76g，磷酸二氢钾 2.96g，水 1000mL。4.如权利要求1所述的培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在于所说的木霉菌Tll-W分生孢子的培养方法为:将木霉菌株Tll-W接种于PDA培养基上，置于28°C下培养一周，将培养所的分生孢子用无菌水洗下，并过滤，并将其稀释至目标浓度IXlO6 cfu/mL。5.如权利要求4所述的木霉菌Tll-W分生孢子的培养方法，其特征在于所说的木霉菌T11-W，分类命名为哈茨木霉，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏，其保藏号为CGMCC N0.7938，保藏时间为2013年7月19日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。6.如权利要求1所述的木霉厚垣孢子的应用，其特征在于用于防治土传的线虫病害。7.如权利要求6所述的木霉厚垣孢子的应用，其特征在于应用木霉厚垣孢子为有效成分配制防治土传的线虫病害的颗粒剂，具体组成如下: 厚垣孢子10重量份 娃藻土70重量份 . 4，47—二羟基二苯甲酮8重量份 糊精10重量份。【文档编号】C12N3/00GK103555648SQ201310377872【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日 【专利技术者】王贻莲, 亚平, 李纪顺, 杨合同, 本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在于将秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌T11?W分生孢子共同加到0.8%琼脂培养基上，于20～25℃的环境，黑暗静止培养8～10天，即可收集厚垣孢子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王贻莲，亚平，李纪顺，杨合同，扈进冬，李红梅，郭凯，陈穗云，孙文向，许银连，尹忠仁，
申请(专利权)人：云南省烟草公司临沧市公司，山东省科学院中日友好生物技术研究中心，昆明保腾生化技术有限公司，
类型：发明
国别省市：