氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，本发明专利技术质粒从实验室自行建成的工业废气生物净化微生物资源菌种库中筛选获得。本发明专利技术的有益效果主要体现在：提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，提高以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解效果，大幅度提高有机废气的处理能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种氯代脂肪烃降解性质粒PRC11、含有该质粒的基因工程菌，以及该工程菌在微生物降解卤代烃类污染物中的应用。
技术介绍
细菌降解性质粒在有机污染物微生物降解过程中起重要作用，它们编码了一些降解过程中的关键酶类，赋予细菌分解代谢各种复杂有机化合物的能力。迄今已报道的卤代烃降解性质粒主要以氯代芳香族化合物降解性质粒为多，如氯代苯甲酸降解质粒1^025、 Pac27和Pwrl，以及2，4-二氯苯氧基乙酸降解质粒？开4，pEML159和pRCIO等。国内关于有机污染物降解性质粒的研究工作开展得比较晚，在80年代末才陆续有一些报道。迄今尚没有氯代脂肪烃降解性质粒的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为了提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRCll、含有该质粒的基因工程菌及其在微生物分解处理氯代有机污染物中的应用。为达到专利技术目的本专利技术采用的技术方案是一种氯代脂肪烃降解性质粒pRCll，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本专利技术质粒从实验室自行建成的工业废气生物净化微生物资源菌种库中筛选获得，命名为pRCll。本专利技术还涉及含有所述质粒pRCll的基因工程菌。本专利技术还涉及所述基因工程菌在微生物降解卤代烃污染物中的应用。具体的，所述卤代烃污染物优选为下列之一 CH2C12、CH2BrCl、C2H4Cl2或C2H2C12。优选的，所述降解在28 32°C、pH6. 8 7. 2下进行。本专利技术提供了一种卤代脂肪烃降解性质粒pRCll，并建立了质粒的物理图谱，对今后利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，消除有关物质的环境污染创造了条件。本专利技术的有益效果主要体现在提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRCll，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，提高以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解效果，大幅度提高有机废气的处理能力。附图说明图1为氯代脂肪烃降解性质粒——pRCll电泳检测图谱；图2为质粒pRCll利用Bam HI、Eco RI、HindIII限制性酶切图谱；图3为pRCll和pJP4物理图谱比较；图4阳性转化子E. coli DH5 (dcm+)对不同卤代烷烃的降解特性。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例1 质粒pRCll的获得及鉴定1)质粒检测(1) 3mL LB菌液培养过夜，7000转/分4°C离心10分钟；(2)重悬于1 mLTE缓冲液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸调整pH值为 7. 9)；(3)加入 2mL 裂解液(3% SDS, 50mM Tris,加 1. 6mL2N NaOH 调整 pH 为 12. 6)裂解，轻摇混勻(4)在50 65°C的水浴中加热20分钟，然后加入2倍体积的氯仿；(5)轻轻振荡乳化，离心破乳(6000转/分，15分钟，40°C )；(6)上清液直接进行电泳分析。用琼脂糖凝胶电泳分析质粒带，条件如下琼脂糖浓度0. 7%，电泳电压80V，电泳缓冲液TBE，marker为λ DNA/HindIII，采用凝胶成像仪分析电泳结果(结果见图1)。2)质粒的提取采用碱法提取质粒。(1)取过夜培养的菌液1. 5mL于微量离心管中，用微量离心以最大转速Vmax离心 3 4s，弃上清，用吸水纸吸干。(2)菌体中加入碱裂解液I 100 μ L，剧烈振荡充分悬浮菌体。(3)加入200 μ L新鲜配置的碱裂解液II，快速柔和颠倒数次，以混合内容物。(4)加入经冰预冷的碱裂解液III 150 μ L,置于冰上5min。(5) Vmax离心5min，取上清，转移至另一新的离心管中，重复该步骤一次。(6)加入等体积的酚氯仿(1 1)，剧烈振荡。(7)Vmax离心2min，用移液枪吸出上清，注意中间层蛋白不要吸出来。(8)加入2倍体积无水乙醇(约ImL)，室温放置2min，Vmax离心5min，弃上清。(9)加入ImL 75%乙醇，将微量离心管颠倒数次，Vmax离心2min，弃上清，用吸水纸洗干，不够干可以离心后用移液枪吸去余液，室温放置2 3min，直至试管内没有可见的液体存在。(10)加入30 μ L含有去DNA酶的RNA酶Μ20 μ g/mL)的超纯水或TE溶液重新溶解核酸，贮存于_20°C。溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOmM EDTA (ρΗ8· 0)；溶液II IOM NaOH 60 μ L, 10% SDS 300 μ L, dd H2O 2640 μ L 总体积 3000 μ L 或 IOM NaOH 20 μ L，10% S DS 100 μ L, dd H2O 880uL 总体积 1000 μ L ；溶液III :3M NaAc (ρΗ4· 8)无水 NaAc 26. 4g 用 70mL ddH20 溶解，用约 20mL 冰乙酸调pH至4. 8，定容至100mL。3)质粒的消除采用丫啶橙消除法。挑单菌落于3mL LB培养基(含氨苄50yg/mL)中，30°C摇床过夜培养，然后取 200 μ L菌液，接入5mL LB培养基(含丫啶橙75mg/L)，30°C摇床培养M小时，然后稀释后， 涂布至以下四个平板①LB平板；②LB平板(含氨苄50yg/mL)；③LB平板(含硝基苯 100mg/L)；④LB平板(含氨苄50 μ g/mL和硝基苯100mg/L)，培养2_3天，检查菌落在平板上的生长情况。4)质粒的转化感受态细胞的制备用接种环挑取甘油保存的DH5 α菌种在LB琼脂平板上划线培养。取琼脂平板上一个单菌落，接种到5mL LB培养基中，37°C振荡培养，至0D_ = 0.3 0.4时，将培养管冷却至0 4°C。取若干灭菌的1.5mL离心管，各加入200 μ L菌液。再各加入过滤除菌的4mol/L CaCl25yL，加上盖，轻弹管底使混勻。即制得感受态菌。质粒转化在感受态细胞中加入5 μ L质粒溶液(DNA ^ IOng)，轻弹离心管底部， 使质粒与细菌混勻。0 4°C冰浴中静置30min。在42°C水浴中，安静放置90 120s。冰浴1 aiiin。37°C，振荡培养45min。将离心管中全部菌液，铺到含相应抗生素的LB琼脂平板上。在37°C温箱中，倒置培养过夜。菌落计数、扩增、鉴定。阳性转化子E. coli DH5 (dcm+)能在16mmol/L的无机盐匪培养基中生长良好，而质粒消除后的E. coli DH5(dcm_)又不能以DCM为碳源生长。E. coli DH5阳性转化子培养 72h的二氯甲烷生物降解效率见表1。表1 大肠杆菌E. coli DH5阳性转化子培养72h的二氯甲烷生物降解效率权利要求1.一种氯代脂肪烃降解性质粒pRCll，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2.含有权利要求1所述质粒pRCll的基因工程菌。3.如权利要求2所述基因工程菌在微生物降解卤代烃污染物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述卤代烃污染物为下列之一CH2C12、 CH2BrCl、C2H4Cl2 或 C2H2Cl2。5.如权利要本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种氯代脂肪烃降解性质粒ｐＲＣ１１，其物理图谱见图３，其核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴石金，陈建孟，邱乐泉，王艳，钟卫鸿，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86