本发明专利技术提供一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括：构建融合表达载体pET32a-THM；将该融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”产品。本发明专利技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本发明专利技术可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及罗非鱼肝脏抗菌肽h印cidin的基因工程制备方法。_
技术介绍
抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽，其抗菌谱广、无耐药诱导性、分子量小而耐热性好，且具免疫调节功能，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用，被认为是饲用抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前旦ο罗非鱼(英文名Tilapia，学名Oreochromis niloticus)抗菌肽h印cidin的特点是分子量小、富含半胱氨酸、带正电荷，属于防御素家族，其分子内由4对二硫键形成的环状结构与抗菌功能有关；由于它兼具广谱抗菌和对铁代谢的负调控作用而越来越受到关注。h印cidin最初是从人的血浆和尿液中分离获得，其成熟肽被确定由25个氨基酸残基组成。随后，有其他哺乳动物和一些鱼类如虹鳟、斑马鱼、鮰鱼和罗非鱼的关于 hepcidin的研究报道，但大多数仅局限于从生物中提取或对其编码基因的克隆方面。据报道，三种h印cidin的同工型基因(TH1-5，TH2-2, TH2-3)从罗非鱼肝脏中被分离，人工合成的TH1-5和TH2-3显示了明显的抗菌功能，但TH2-2无抗菌功能。迄今为止，还未见关于罗非鱼h印cidin重组DNA表达方面的报道。很显然，目前抗菌肽制备中存在的问题是生物机体中含量甚微，直接提取困难重重，化学合成成本又太高，无法大量获得。因此，通过基因工程技术制备抗菌肽无疑是目前研究开发的最佳方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种制备罗非鱼抗菌肽h印cidin的方法，包括(1)将该抗菌肽的编码基因THM与质粒ρΕΤ3^ι构建为融合表达载体ρΕΤ3^ι-ΤΗΜ ； (2)将ρΕΤ3^ι-ΤΗΜ融合表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，构建表达工程菌；(3)发酵培养表达工程菌，并进行IPTG 诱导表达；(4)发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及(5)抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼h印cidin成熟肽“THM”产品。在本专利技术的一实施方式中，其中步骤(1)包括以罗非鱼肝脏组织为材料提取总 RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA ；设计两条引物THM-F 5，CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’ JPTHM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3’，其中下划线为I 禾III 酶切位点， 以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码抗菌肽“THM”的DNA片段，测序确证后，通过双酶切与质粒PET3M连接，构建成融合表达载体pET3h-THM。在本专利技术的实施方式中，步骤(4 )包括从发酵液收集细胞，超声破碎及离心后所得上清液采用M-IDA亲和柱层析纯化得到抗菌肽融合蛋白。在本专利技术的实施方式中，步骤(3)在添加IPTG诱导表达之前还添加终浓度为 0. 5%-1% (v/w)葡萄糖(比如IOOOml的培养基，它如果含有0. 5%葡萄糖，里面就有0. 5% xl000=5克的葡萄糖)本专利技术应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本专利技术可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。附图说明图1是罗非鱼抗菌肽h印cidin表达载体重组质粒pET3h_THM的构建示意图2是融合蛋白的Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析图，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰；图3是h印cidin的成熟肽“THM”的分子筛层析图，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰；及图4是融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳分析图。具体实施例方式本专利技术使用pET3h为表达载体质粒，使用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主菌，以融合蛋白的形式表达罗非鱼抗菌肽h印cidin同工型TH1-5 (即THM)，并进行体外抗菌活性和热稳定性鉴定。下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。实施例罗非鱼抗菌肽h印cidin的制备 (1)构建表达载体首先以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA ；根据抗菌肽h印cidin成熟肽“THM”的编码序列(见SEQ ID NO: l)、pET32a的多克隆位点，设计合成两条引物如下THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’THM-R 5，CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3，，其中，下划线为 &0R I 禾口历III 酶切位点。以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码“THM”的DNA片段，将此片段插入克隆载体PSURE，测序确证后，通过双酶切获得该片段，然后与表达载体pET3h连接(16°C、 过夜)，载体构建见图1。(2)构建基因工程菌用上述表达载体转化宿主菌(45°C、30秒)，宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)； (3)诱导表达采用LB培养基(含lOOg/mL氨苄)，还添加终浓度为0. 5%-l%(w/v)葡萄糖(比如IOOOml的培养基，它如果含有0. 5%葡萄糖，里面就有0. 5% xl000=5克的葡萄糖)，371、220转/ 分发酵培养表达工程菌约4小时至0D600达到0. 6 ；加入终浓度0. lmmol/L的IPTG、25°C、 110转/分诱导表达约12小时； (4)融合蛋白的纯化发酵液离心(8000g，4°C，10min)，沉淀重悬于 PBS (140mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, ρΗ7· 3)中超声破碎 30 秒，离心(12000g，4°C，lOmin)，上清用作下一步上柱纯化。采用Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析，以4倍柱床体积的结合缓冲液 (20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L 尿素，500mmol/L NaCl, 5mmol/L 咪唑，pH 8. 0)平衡柱， 上样；8倍柱床体积的洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L尿素，500mmol/L NaCl, 500mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。收集蛋白，洗脱峰如图2所示，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰。根据对总蛋白浓度和融合蛋白浓度的测定结果，计算得到融合蛋白的表达量约占总蛋白表达量的20-30%。(5)融合蛋白的酶切和分子筛层析肠激酶反应体系肠激酶(用量为每50 g融合蛋白一个酶活单位)，25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaCl, 2mmol/L CaCl2 ;25°C，反应 16 小时。采用分子筛层析，分离介质为Superdex G75，用25mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)缓冲液平衡5个柱体积，上样，25 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱。收集蛋白峰，得到罗非鱼 hepcidin成熟肽“THM”。分子筛层析图如图3所示，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰。融合蛋白的jTricine-SDS-PAGE检测制备16. 5% T, 6% C浓度的分离胶、4% T, 3% C浓度的浓缩胶，最终纯化样品2. ^ig/ mL，与上样缓冲液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备罗非鱼抗菌肽ｈｅｐｃｉｄｉｎ的方法，包括：（１）将该抗菌肽的编码基因ＴＨＭ与质粒ｐＥＴ３２ａ构建为融合表达载体ｐＥＴ３２ａ－ＴＨＭ；（２）将ｐＥＴ３２ａ－ＴＨＭ融合表达载体转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），构建表达工程菌；（３）发酵培养表达工程菌，并进行ＩＰＴＧ诱导表达；（４）发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；（５）该抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼ｈｅｐｃｉｄｉｎ成熟肽“ＴＨＭ”产品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陶妍，文雅，沈彦萍，
申请(专利权)人：上海沈李科工贸有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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