家畜口蹄疫病毒A、O型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法技术

涉及一种家畜口蹄疫病毒和双价多肽疫苗以及遗传工程领域，尤其是一种Ａ、Ｏ型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法。克隆了Ａ、Ｏ型口蹄疫病毒ＶＰ１的抗原决定簇，将其串联与能显著提高其免疫原性的大片段相连后，插入原核表达载体，诱导表达的蛋白经纯化后制成具有口蹄疫Ａ、Ｏ型免疫原性的双价多肽疫苗。其制备方法为在湿菌加缓冲液，离心，收集上清；将平衡的Ｎｉ↑［＋］－ＮＴＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　６Ｂ加至上清中，将凝胶装到层析柱上；用缓冲液洗脱；收集，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；再作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。能同时有效地预防Ａ、Ｏ型口蹄疫病毒，安全可靠。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种家畜口蹄疫病毒(FMDV)和双价多肽疫苗以及遗传工程领域，尤其是一种A、O型基因工程双价多肽疫苗及其制备方法。(2)
技术介绍
口蹄疫是致偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染性高而著称，国际兽疫局将其列为A类传染病之首。传统的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质，即病原体在培养、纯化后，或者被灭活，或者被降低其毒性。这两种疫苗虽然具有较好的免疫原性，但是生产的安全性较差，需要对实验室以及参加实验的工作人员采取保护措施，保证不被致病物质污染保证病毒不泄漏。在疫苗生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。绝大多数的现行疫苗的有效期都很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。DNA重组技术的发展为制造新一代的重组疫苗提供了新思路。虽然目前已克隆了口蹄疫病毒VP1蛋白并制成口蹄疫疫苗，但是其免疫原性弱，对动物的保护效果尚不理想。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，共包括A、O、C等7种血清型。我国主要以O型为主，A型口蹄疫也时有发生。目前口蹄疫的基因工程疫苗均为单价。1986年美国伊莱公司(CN86103718A)提出一种口蹄疫疫苗的制备方法，它是有治疗或预防口蹄疫活性的化合物。这种化合物含有结构式X-A-Y-B-Z序列，其中A和B是组成口蹄疫病毒VP外壳蛋白血清型序列的氨基酸残基序列，其中一个含有18到24氨基酸残基，并包括O血清型141-158位上氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列，而另一个含有14到20氨基酸残基，并包括O血清型200到213位上的氨基酸残基序列或其它血清型的相同序列。1999年香港科技大学(CN1270839A)提出一种口蹄疫的抗原化抗体疫苗，它属于一种治疗猪口蹄疫的疫苗，此疫苗是将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体CDR环而产生的抗原化抗体疫苗。可通过PCR由FMDV的VP1基因克隆FMDV肽表位。使用重叠的PCR法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内，将所得的抗原化抗体基因克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或骨髓瘤细胞，选择稳定的转染子细胞系以大量产生所需的蛋白质疫苗。2000年中国科学院上海植物生理研究所提出一种新型口蹄疫苗及其制备方法，它是一种新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其编码序列，以及这些融合蛋白在口蹄疫的诊断和预防上的用途。还提供了含有这些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法。所说的融合蛋白，是在烟草花叶病毒外壳蛋白的第155-156位氨基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异性表位。该口蹄疫病毒特异性表位的长度为11-14个氨基酸。该口蹄疫病毒特异性表位选自下组SEQ ID NO2、3和4。2001年深圳市三方圆信息技术有限公司提出一种家畜口蹄疫基因工程苗及其制造方法，工程苗是由病毒RNA反转录获得并可编码VP1蛋白的全DNA序列，是在包括植物的根茎叶和种子在内的植物反应器中形成的立体结构的总和，分子量为30-150KDa，通过将VP1全基因插入质粒载体、重组质粒转入植物中表达和转基因种子种入土壤获得可作为疫苗的植物等过程。(3)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能同时有效地预防A、O型口蹄疫病毒的、安全可靠的疫苗及其制备方法。本专利技术克隆了A、O型口蹄疫病毒VP1的抗原决定簇，将其串联与能显著提高其免疫原性的大片段相连后，插入原核表达载体，诱导表达的蛋白经纯化后制成具有口蹄疫A、O型免疫原性的双价多肽疫苗。本专利技术是一种能预防A、O型口蹄疫病毒的双价多肽疫苗。是将编码A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白中的抗原决定簇部分连接。为增强其免疫原性，在该基因的末端连接上一段中间包含O、A型口蹄疫病毒抗原簇的大片段。其核苷酸序列为1GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCG CGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGACGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCT241 GTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGAC301 ACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCAT361 ACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTG421 GGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCAGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAG481GTTTTGGCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGC541TCTTTGGCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCACTCGAGTCCAGGGAATTAGTAGTCAGC601 TATGTCAATGTTATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTT661 ACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACT721 CCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT781 GTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCT841 CAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGAAGCTT其中7～72，85～126，451～513为VP1蛋白的O型抗原决定簇；133～192，514～573为VP1蛋白的A型抗原决定簇；205～450，574～894为有利于FMDV多肽疫苗形成一定空间结构的载体蛋白；其他序列为连接片段。本专利技术的疫苗，其包涵体变性蛋白经Ni+-NTA-Sepharose 6B亲和层析柱在非变性的条件下直接分离纯化，具体步骤如下1)在湿菌加缓冲液(buffer)A(6M盐酸胍，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)，离心，收集上清；2)将用buffer A平衡的Ni+-NTA-Sepharose 6B加至上清中，将凝胶装到层析柱上；3)用buffer A和buffer B(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH8.0)洗脱；4)用buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/HCl，pH6.3)洗脱；5)用buffer D(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris/本文档来自技高网...

【技术保护点】
家畜口蹄疫病毒Ａ、Ｏ型基因工程双价多肽疫苗，其特征在于其核苷酸序列为：　　　　１　　ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＧＴＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴ　　　　６１　　ＣＧＴＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＴＣＧＣＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧ　　　　１２１　　ＡＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧ　　　　１８１　　ＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴ　　　　２４１　　ＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣ　　　　３０１　　ＡＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴ　　　　３６１　　ＡＣＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧ　　　　４２１　　ＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＧ　　　　４８２　　ＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＡＴＧＧＧＣ　　　　５４２　　ＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣ　　　　６０１　　ＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴ　　　　６６１　　ＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴ　　　　７２１　　ＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴ　　　　７８１　　ＧＴＴＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴ　　　　８４１　　ＣＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，邵寒娟，沈明山，苏勇波，林涛，郭小玲，
申请(专利权)人：厦门厦大建南应用技术有限公司，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]