一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化植物组织基因组DNA的方法。本发明专利技术裂解样品是采用两种裂解液，其中第一种裂解液中含有质量体积比为2％～5％PVP、2％～5％CTAB和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有3～6M盐酸胍、体积分数为2％～5％Triton?X-100；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml?RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液。该纯化方法操作简便，纯化过程快速，无需分步裂解组织，极大程度的满足对多种植物及其不同部位基因组DNA的提取，具有纯化率高，DNA完整性好、纯度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用金磁微粒纯化多种类型植物及不同部位的植物组织基因组DNA 的方法。
技术介绍
利用带有目的基因的供体植物DNA直接转化受体，筛选目的性状变异后代，是植物基因工程与分子生物技术在农业上的实际应用。从不同种属的植物及其不同部位提取出质量较高的基因组DNA进行后续的PCR反应等下游实验是一个关键环节，建立的方法对提取得到的基因组DNA的纯度及浓度有较高要求。目前，植物组织基因组DNA提取方法都有很强的针对性，而且大都只能从新鲜的植物叶片中提取，这样以来会对下游应用带来很大的局限性。核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。传统的几种植物基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有的植物基因组DNA纯化的文献报道基本上都是针对某种植物的新鲜叶片，如针对烟草的叶片、番茄叶片等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织或同一植物的不同组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不便。因此，研究通用、快速适于植物不同部位组织基因组DNA的方法也非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化植物组织基因组DNA的方法，以解决
技术介绍
操作复杂、纯化率低、不具有通用性等问题；可适用于纯化不同植物的组织及同一植物不同组织。本专利技术的技术方案一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法，包括以下步骤1)制备含有基因组DNA的样品裂解液取植物组织样本，分别加入100 800 μ 1的两种裂解液，其中第一种裂解液中含有质量体积比为2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 和体积分数为0. 5% 2% β -巯基乙醇，第二种裂解液中含有3 6Μ盐酸胍、体积分数为 2% 5% iTriton Χ-100 ；混勻后于水浴中充分裂解5 30min，再加入10 50 μ 1的IOmg/ ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示溶质的质量与该种裂解液的体积的比)2)用氯仿抽提后离心用0.6ml 1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后SOOOrpm 13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；3)结合取400 1000 μ g金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；4)清洗对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混勻，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；5)洗脱将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混勻，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。上述步骤1)中所述第一种裂解液中含有质量体积浓度为2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0. 5% 2% β -巯基乙醇，第二种裂解液中含有3 6Μ盐酸胍、体积分数为2% 5% Triton X-100以及0. 005 0. OlM 乙二胺四乙酸(EDTA)、0· 5 2M NaCl 和 0. 05 0. 2M Tris-HCl。上述步骤幻中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为IM 3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000 10000之间，浓度为10% 30% ； 也可以选择公知的其他结合缓冲液。上述步骤5)中所述洗脱液优选含有IOmM Tris-HCl和ImM EDTA、pH = 8. 0的TE 溶液或无核酶水。上述步骤2、采用氯仿只需进行一次样本抽提。上述步骤4)中所述清洗液可以采用50% 85%的乙醇。上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50 65°C。本专利技术通过采用两种裂解液搭配使用，无需分步裂解组织，极大程度的满足对多种植物及其不同部位基因组DNA的提取。1、本专利技术使用了两种不同的裂解液——CTAB裂解和胍盐裂解，采用两种裂解液搭配使用裂解植物组织细胞，可以囊括大部分种类的植物以及不同部位的植物组织，满足从多种植物不同部位提取高质量的DNA的需求，得到的DNA纯度高，不含有抑制下游PCR反应的抑制剂。2、不需要反复抽提与离心，减少了机械使用中的物理性剪切，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。3、不需要分步裂解，步骤简便，时间短，全部过程只需要35 60min左右(根据不同样本，裂解的时间不同)，从而大大缩短了提取DNA的时间。4、该纯化方法操作简便，纯化过程快速，得到的基因组DNA质量高成本低廉；具有纯化率高，DNA完整性好、纯度高等优点。5、可以适用多种植物基因组DNA的提取，如烟草、番茄、芦荟等；也可用于同一植物不同组织基因组DNA的提取，如根、茎、叶片，幼苗等组织。附图说明图1是本专利技术提取的基因组DNA的电泳图；其中泳道M XHind III ；泳道1 从烟草叶片中提取的基因组DNA ；泳道2 从番茄幼苗中提取的基因组DNA泳道3 从烟草根中提取的基因组DNA泳道4 从烟草茎中提取的基因组DNA。具体实施例方式利用磁性载体进行核酸纯化是近年来发展起来的一种DNA纯化的思路，即利用具有超顺磁性的纳米或微米级球形颗粒作为固相介质来非特异性的吸附核酸，在外加磁场的作用下将DNA-磁性微粒复合体与蛋白质、多糖等杂质分离开来，可省去反复离心、过滤等繁杂的操作，减少了过多的机械剪切作用对核酸造成的损伤，而当撤去磁场后，磁性微粒很快均勻分散于溶液中。由于它具有操作简便、纯度高等特点，越来越受到人们的亲睐，并且它易于实现自动化，满足了样本中大规模建库等高通量操作的需求。金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包裹单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括 Fe3O4, y -Fe2O3等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由!^e与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的狗304、Y_Fe203等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质i^、C0、m粒子聚集体，或经修饰后形成的！^与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。以下结合实施例对本专利技术即金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法进一步的说明。实施例1 用金磁微粒从烟草叶片中纯化基因组DNA的方法1)植物样本裂解1. 1)取新鲜植物叶片组织IOOmg用蒸馏水清洗干净，将表面水分擦干，剪碎后置于2ml离心管中，加入液氮研磨。在组织解冻前加入100 μ 1裂解液2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0. 5% 2% β -本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用金磁微粒纯化植物组织基因组ＤＮＡ的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：１）制备含有基因组ＤＮＡ的样品裂解液取植物组织样本，依次加入１００～８００μｌ的两种裂解液，其中第一种裂解液中含有质量体积比为２％～５％聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、２％～５％十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）和体积分数为０．５％～２％β－巯基乙醇，第二种裂解液中含有３～６Ｍ盐酸胍、体积分数为２％～５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００；混匀后于水浴中充分裂解５～３０ｍｉｎ，再加入１０～５０μｌ的１０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ溶液，得到含有基因组ＤＮＡ的样品裂解液；２）用氯仿抽提后离心用０．６ｍｌ～１．２ｍｌ氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后８０００ｒｐｍ～１３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，得到含有基因组ＤＮＡ的上清；３）结合取４００～１０００μｇ复合物；５）洗脱将洗脱液与金磁微粒－基因组ＤＮＡ复合物混匀，使基因组ＤＮＡ从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组ＤＮＡ溶液。金磁微粒与含有基因组ＤＮＡ的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒－基因组ＤＮＡ复合物的溶液；４）清洗对含有金磁微粒－基因组ＤＮＡ复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒－基因组ＤＮＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚丽，魏旭旭，晁旭，张景阁，赵稳操，李谭杰，
申请(专利权)人：西安金磁纳米生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：87