一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法技术

本发明专利技术公开了一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法。该快速分型检测方法包括以下几个重要的环节：基于AS-PCR的方法，对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17等位基因位点进行识别与扩增。利用扩增片段标记的生物素和纳米金磁微粒表面链亲和素相互作用，结合侧向流技术，实现基因分型快速检测。利用金磁微粒作为杂交载体，无需对目的片段进行纯化、浓缩而导致的高成本、费时、费力的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种个体化用药检测技术，具体涉及针对心血管抗凝药基因个体化用药之快速分型检测方法。
技术介绍
《中国心血管病报告2010》显示，我国每年300万人死于心血管疾病，居死因之首，其用药安全和有效性备受关注。氯吡格雷已成为临床抗血栓治疗的一线用药。然而，约30%患者服用该药后疗效不佳，甚至产生严重不良反应。研究表明，氯吡格雷抵抗与ABCBl基因多态性、细胞色素P450酶代谢活性、ADP受体多态性均相关。其中CYP2C19基因多态性(关于细胞色素P450酶代谢活性)是增加心肌梗死、中风和支架内血栓的主要影响因素，其多态性会导致药物代谢酶的多态性，使酶活性呈现高、低或无活性状态。因此，代谢类型被分为了以下四种超强代谢UM (纯合超强代谢CYP2C19*17/*17，杂合超强代谢 CYP2C19*1/*17)、强代谢组EM (纯合强代谢CYP2C19*1/*1 )、中间代谢组頂(杂合型中间代谢CYP2C19*l/*2和CYP2C19*l/*3)及弱代谢组PM (杂合型弱代谢CYP2C19*2/*3，纯合型弱代谢CYP2C19*2/*2)。以基因分型为基础的个体化用药治疗会成为降低不良反应和增加药效的一种有效手段。研究表明CYP2C19*2和CYP2C19*3两种突变可解释>99%的东方人弱代谢者以及约88%的白种人弱代谢者的表型。其中*2突变是PM产生的主要原因。中国人群CYP2C19*2和*3等位基因占30%及8%，CYP2C19*2和*3基因被证实为亚洲人对该药抵抗的危险因素。荧光定量PCR、质谱法、基因芯片或传统的酶切方法相比，均已被用来检测SNPJS这些方法存在操作复杂、检测时间长，或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制，因此并不适合于大多数临床医院在常规的临床检验中推广使用，所以研究并开发用于个体化用药相关新型检测关键技术和相关检测广品有重大意义。专利技术目的本专利技术的目的是提供，以解决
技术介绍
的方法操作复杂、检测时间长等问题、或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制。为实现上述专利技术目的，本专利技术提出了以下基本技术方案，包括以下步骤(I)针对待检测样本基因组 DNA 的 CYP2Cl9*2 (681G>A), CYP2C19*3 (636G>A),CYP2C19*17 (-8060T)这三个SNP位点，对每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的Y端均标记地高辛，共用引物的Y端标记生物素；(2)针对一个SNP位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应条件相同并同时置于PCR仪中反应；这样，对于(I)步骤中所述的三个SNP位点，共做六管PCR反应；Taq聚合酶的特异性决定了 PCR反应能否顺利进行；(3)利用链亲和素金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以生物素和链亲和素作用，对步骤(2)得到的扩增产物中SNP基因型完成分型检测；其中，层析技术采用的试纸条满足a、试剂条的免疫层析膜(硝酸纤维素膜)上的质控线处包被有质控用生物素；b、检测线处包被有捕获用抗地高辛抗体；C、结合垫上喷涂有链亲和素金磁微粒；经步骤(2)取出的两管PCR产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，质控线显色表明此次实验有效，即步骤(2)的该管PCR反应顺利，即得到的产物一端标记有生物 素，另一端标记有地高辛，滴加至上样垫，一端的生物素与链亲和素磁粒特异性结合之后，通过层析作用上移至检测线处，另一端上的地高辛与检测线上的抗地高辛抗体特异性结合显色，由此判断出其基因型滴加含有野生型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。上述步骤⑴中设计的引物序列如下CYP2C19*2 (681G>A)引物序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对待检测样本基因组DNA的CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（？806C>T）这三个SNP位点，对每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；(2)针对一个SNP位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应条件相同并同时置于PCR仪中反应；这样，对于（1）步骤中所述的三个SNP位点，共做六管PCR反应；Taq聚合酶的特异性决定了PCR反应能否顺利进行；(3)利用链亲和素金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以生物素和链亲和素作用，对步骤(2)得到的扩增产物中SNP基因型完成分型检测；其中，层析技术采用的试纸条满足：a、试剂条的免疫层析膜上的质控线处包被有质控用生物素；b、检测线处包被有捕获用抗地高辛抗体；c、结合垫上喷涂有链亲和素金磁微粒；经步骤(2)取出的两管PCR产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，质控线显色表明此次实验有效，即步骤(2)的该管PCR反应顺利，即得到的产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至上样垫，一端的生 物素与链亲和素磁粒特异性结合之后，通过层析作用上移至检测线处，另一端上的地高辛与检测线上的抗地高辛抗体特异性结合显色，由此判断出其基因型：滴加含有野生型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。...

【技术特征摘要】
1.一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)针对待检测样本基因组DNA 的 CYP2C19*2 (681G>A)、CYP2C19*3 (636G>A)、CYP2C19*17 (-8060T)这三个SNP位点，对每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的Y端均标记地高辛，共用引物的Y端标记生物素； (2)针对一个SNP位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应条件相同并同时置于PCR仪中反应；这样，对于(I)步骤中所述的三个SNP位点，共做六管PCR反应；Taq聚合酶的特异性决定了 PCR反应能否顺利进行； (3)利用链亲和素金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以生物素和链亲和素作用，对步骤(2)得到的扩增产物中SNP基因型完成分型检测； 其中，层析技术采用的试纸条满足 a、试剂条的免疫层析膜上的质控线处包被有质控用生物素； b、检测线处包被有捕获用抗地高辛抗体； C、结合垫上喷涂有链亲和素金磁微粒； 经步骤(2)取出的两管PCR产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，质控线显色表明此次实验有效，即步骤(2)的该管PCR反应顺利，即得到的产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至上样垫，一端的生物素与链亲和素磁粒特异性结合之后，通过层析作用上移至检测线处，另一端上的地高辛与检测线上的抗地高辛抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秦鲁，魏旭旭，朱娟莉，惠文利，崔亚丽，
申请(专利权)人：西安金磁纳米生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：