本发明专利技术涉及一种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法，该方法包括步骤：（1）采集缢蛏个体，提取DNA；（2）合成线粒体细胞色素氧化酶I标记引物；（3）对缢蛏群体的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因进行PCR扩增；（4）对PCR产物进行纯化；（5）对纯化的PCR产物进行测序和序列比对。该方法该结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种缢蛏种质鉴定，具体说，涉及ー种利用线粒体分子标记鉴定缢蛏群体的方法。
技术介绍
缢蛏是我国四大海产养殖贝类之一，具有生长快、养殖周期短、易管理、产量高、效益好等养殖特点。据统计，我国贝类的养殖产量占海水养殖总产量的82%。滩涂贝类的年产量近200万吨，其中缢蛏的产量就已经达到了 70万吨，约占我国滩涂贝类养殖总产量的30%，在我国海水养殖中占有重要的地位。例如，我国浙江和福建一帯沿海是缢蛏的重要苗种产区，被运输到其他沿海城市 进行养殖和销售。近几年，随着缢蛏养殖规模的不断扩大，江苏和上海沿海滩涂也逐步开始引种养殖。异地苗种引进和养殖容易导致异地苗种与土著苗种的混杂，因此如何区分不同地区苗种以期进行后期苗种选择，种质资源保护和良种选育工作成为重要的课题。由于不同群体缢蛏表型相近，且容易受到环境因素的影响，因此依靠表型进行群体鉴别具有相当困难。线粒体属于母系遗传，变异速度较快，采用线粒体分子标记进行缢蛏群体的鉴别是非常可靠的分子生物学方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种利用线粒体分子标记鉴定缢蛏群体的方法，该方法可靠性高。为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案是ー种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法，该方法包括以下步骤( I)采集缢蛏个体，提取DNA ；(2)合成线粒体细胞色素氧化酶I标记引物；(3)对缢蛏群体的线粒体细胞色素氧化酶I (COI)基因进行PCR扩增；(4)对PCR产物进行纯化；(5)对纯化的PCR产物进行测序和序列比对。在本专利技术的一优选实施例中，步骤(I)中，所述标记引物为Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5，TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。在本专利技术的一优选实施例中，步骤(2)中，所述PCR扩增程序为(a) 94°C预变性3min,进行35个循环(b)94°C变性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s ；(c)最后 72°C延伸 lOmin。在本专利技术的一优选实施例中，步骤(2)中，所述PCR扩增所用反应体系为25 ii L，含IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. OmmoI/dm3, dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 IU，上、下游引物各 0. 2 Ii mol/dm3,模板 DNA50_100ng。本专利技术的方法，鉴别方法简单，可靠性强。附图说明图I是缢蛏江沪群体和浙闽群体的线粒体分子标记细胞色素氧化酶I(COI)序列。其中“*”表示江沪群体和浙闽群体的保守位点，“ ”表示鉴别江沪群体和浙闽群体的碱基位点，JSSc, SHSc, ZJSc和FJSc分别表示江苏，上海，浙江和福建缢蛏个体。具体实施例方式下面结合实施例进ー步说明本专利技术。 实施例I :利用本专利技术的方法，对缢蛏江沪群体和浙闽群体进行鉴别。(I)采集江苏、上海、浙江和福建沿海滩涂的缢蛏个体，提取DNA ；在我国江苏、上海、浙江和福建沿海滩涂随机采集缢蛏个体。利用解剖刀和镊子分别收集四个地区的缢蛏个体的外套膜组织，置于无水こ醇中保存备用。采用酚氯仿抽提法进行DNA抽提，具体方法如下。每个样本取0. 5g外套膜组织剪碎后，加入 500 u L 组织勻衆缓冲液(10mmol/dm3 Tris-Hcl, PH=8. 0; 50mmoI /dm3 EDTA,PH=8. 0)，混匀后加入终浓度为1%的SDS和200 u g/cm3的蛋白酶K，55°C消化澄清。利用饱和酚抽提I次，然后利用等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)提取2次，再次利用氯仿异戊醇(24 1)抽提I次，最后加入2倍体积预冷的无水こ醇沉淀，70%こ醇洗涤两遍后干燥，无菌水溶解DNA。紫外分光光度计测定样品DNA的0D260、0D280值，确定其浓度和纯度，母液置于_20°C保存。(2)合成线粒体细胞色素氧化酶I (COI)引物；线粒体细胞色素氧化酶I (COI)引物的合成，采用固相亚磷酰胺三酯法，由DNA合成仪合成引物碱基序列，通过PAGE法纯化弓I物。序列为Sc-COI-F:5，GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG 3，；Sc-C0I-R :5，TAAACTTCAGGGTGACCA AAA AATCA 3’(3)线粒体细胞色素氧化酶I (COI)的PCR扩增利用合成的引物进行细胞色素氧化酶I (COI)的PCR扩增，扩增反应在德国艾本德PCR仪上进行，具体实施如下PCR扩增程序94°C预变性3min，进行35个循环94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸50s，最后72°C延伸IOmin0PCR 扩增所用反应体系为 25 ii L，含 IOXBuffer 2. 5 u L, Mg2+2. Ommo I/dm3,dNTPO. 2mmol/dm3, TaqDNA 聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2 y mol/dm3，模板 DNA50_100ng。(4 )对PCR产物进行纯化；PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下将PCR产物进行切胶回收，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，具体操作步骤參考纯化试剂盒说明书(购自上海生エ生物工程有限公司)。( 5 )对纯化的PCR产物进行测序和序列比对采用ABI3730测序仪进行PCR产物双向测序,测序引物为PCR扩增引物。测序结果经过拼接校对后，利用 Clustal W2 软件(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)进行序列比对，获得不同序列间的保守碱基和变异碱基，通过变异碱基鉴定不同地区的缢蛏群体。本实施例中鉴别缢蛏两个群体的线粒体分子标记细胞色素氧化镁I (COI)序列为图I所示。由缢蛏江沪群体和浙闽群体共计4个体线粒体COI基因400bp序列的排序结果可以看出，两个群体存在21个碱基变异，包括17个转化和4个颠换，分别为第8，35，59，125，131，134，137，155，170，188，275，281，290，331，332 碱基为 A-G 转换，156，347 碱基为 C-T 转换，第140，249，269碱基为C-G颠换，第251碱基为A-T颠换。该结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单，可以作为鉴别缢蛏江沪群体和浙闽的分子标记。以上显示和描述了本专利技术的基本原理、主要特征和本专利技术的优点。本行业的技术·人员应该了解，本专利技术不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本专利技术的原理，在不脱离本专利技术精神和范围的前提下本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本专利技术要求保护的范围内。本专利技术要求保护的范围由所附的权利要求书及其等同物界定。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）采集缢蛏个体，提取DNA；（2）合成线粒体细胞色素氧化酶I标记引物；（3）对缢蛏群体的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因进行PCR扩增；（4）对PCR产物进行纯化；（5）对纯化的PCR产物进行测序和序列比对。
【技术特征摘要】
1.ー种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)采集缢蛏个体，提取DNA； (2)合成线粒体细胞色素氧化酶I标记引物； (3)对缢蛏群体的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因进行PCR扩增； (4)对PCR产物进行纯化； (5)对纯化的PCR产物进行测序和序列比对。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述标记引物为Sc-COI-F :5’ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’ ；Sc-COI-R :5’ TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AA...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛东红，李家乐，沈和定，王劦，金凯，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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