牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用，发现一株野毒株传染性牛鼻气管炎病毒，首先样品经PCR和荧光PCR鉴定后，然后在MDBK细胞经培养基加经检测没有IBRV的牛血清，培养一定时间，长成单层细胞，用处理过的样品接种后，观察细胞病变，取病变细胞样PCR鉴定为阳性后，TCID50测定为106.2，病毒中和实验，病毒滴度为27，再接种到单层细胞中，待70％-80％的有细胞病变时，将细胞收入-40℃冰箱保存，预防牛的传染性牛鼻气管炎病的工程疫苗的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种传染性牛鼻气管炎病毒，具体涉及一种预防牛的传染性牛鼻气管炎病的细胞工程疫苗。
技术介绍
传染性牛鼻气管炎病是严重危害世界养牛业的一种重要的病毒性传染病。该病的主要病原为传染性牛鼻气管炎病毒，防制该病主要是用病毒药物和化学药物，但因存在敏感性和药物残留等不足，研制新型的疫苗是当务之急。牛传染性鼻气管炎病毒具有疱疹病毒科成员所有的形态特征，带有囊膜的成熟病毒粒子直径约为150nm 220nm，病毒呈球形，核衣壳为立体对称20面体，其上有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜，并含有一条较大的双股DNA分子。牛传染性鼻气管炎(infectiousbovine rhinotracheitis, IBR)是由 I 型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus-1,BHV-1)引起牛的一种以上呼吸道炎症为主的接触性传染病， 临床表现多种多样，以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征牛。传染性鼻气管炎病毒存在潜伏感染的问题，病愈的牛或感染后能够长期带毒，甚至终身带毒，但不排毒。不过，在条件合适时，潜伏感染的病毒可能被活化而出现排毒现象，成为感染源。潜伏感染的机理是，由于病毒基因组掺合进入非繁殖性细胞里，特别是外周神经节的神经细胞， 主要是三叉神经节细胞中。就是说牛传染性鼻气管炎病毒能长期潜伏在神经细胞里。自50 年代在美国发现至今，此病已蔓延至世界各地。该病毒最大的特点是组织嗜性宽广，除经常侵害呼吸系统外，还能侵害生殖系统、神经系统、眼结膜和胎儿。另外，自然感染时，发病程度的差异也很大，最轻的是临床症状的不显性感染，或只表现体温轻度升高；重者则侵害整个鼻腔(鼻窦)、咽喉和气管，继发急性上呼吸道炎症。目前中华人民共和国动植物检疫局已明确规定凡是进出口的牛及其制品，必须检测IBRV，以便控制本病的发生与流行。检测 IBRV的传统方法为血清学方法，如中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验以及核酸探针等。这些方法都存在着不同程度的缺点，或检测灵敏度不高，或费时、费力，或有假阳性； 而PCR简单易操作且灵敏度高。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用。为解决上述的问题，本专利技术通过以下技术方案来实现牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用，包括a、用无菌棉签提取发病牛鼻腔分泌物送实验室，得腔棉拭子样本；b、以gB-Ι和gB-2为引物，用PCR方法进行检测扩增，病料中扩增出特异性片段， 以gB-F、gB-R为引物，用PCR和荧光PCR方法检测扩增，鉴定传染性牛鼻气管炎病毒，检测结果均为阳性；C、在MDBK细胞经培养基加经检测没有IBRV的牛血清，后培养一定时间，长成单层MDBK细胞，用PCR和荧光PCR方法检测的腔棉拭子样本接种于单层MDBK细胞，观察细胞病变，待70% -80%细胞出现病毒病变时，将细胞收入_40°C冰箱保存。分离出的牛传染性鼻气管炎病毒毒株，已经在菌种保藏中心登记入册编号为 CGMCC No. 4655，名称为 GD0109。采用Reed-Muench法，将分离毒株加入MDBK细胞悬液，逐日观察，计算分离毒株的 TCID50效价，分离毒株冻融3次后分装，病毒的TCID50为106. 2。将分离毒株与IBRV参考阳性血清混合后，观察细胞病变，IBRV参考阳性血清对分离毒株的中和抗体滴度为27。在作为预防牛的传染性牛鼻气管炎病的工程疫苗的应用。本专利技术牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用有以下优点和应用前景1、本专利技术PCR检测方法鉴定牛传染性鼻气管炎病毒毒株简单容易操作，灵敏度高，准确度高。2、本专利技术可预防牛传染性鼻气管炎病的细胞工程疫苗。 具体实施例方式观察牛群发病情况取病样初步诊断，取病牛临床表现为眼鼻流出浆性、粘液性或脓性分泌物，体温升高，精神沉郁，食欲减退，产乳量减少，有少量牛流涎，咳嗽，临床初步诊断为传染性鼻气管炎，用无菌棉签采取发病牛鼻腔分泌物，送实验室诊断。实施例1 利用PCR检测鉴定传染性牛鼻气管炎病毒，在牛鼻腔棉拭子中加入 0. 01mol/L PBS，充分振荡冲洗后，取冲洗液200μ L用Viral Nucleic AcidExtraction Kit II DNA提取试剂盒提取DNA，IBRV PCR方法和IBRV荧光PCR方法进行检测，PCR引物为gB-Ι :5，-TAC GAC TCG TTC GCG CTC TC-3，；gB-2 5' -GGT ACG TCT CCA AGC TGC CC-3'；扩增片段大小为47m3p，25yLPCR反应体系中加入2XMaster Mix 12. 5yL(TAKARA公司产品)、样本核酸5yL、ddH20至25yL。扩增条件为95°C预变性 5min，95°C lmin，65°C 45s, 72°C 45s, 10 个循环；95°C lmin，54°C 45s, 72°C 45s, 15 个循环； 95°C lmin,60°C 45s, 72°C 45s，10 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。PCR 产物用 1.6%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，结论为病料中扩增出特异性片段。实施例二 和荧光PCR检测鉴定传染性牛鼻气管炎病毒，荧光PCR引物为gB-F :5，-TGT GGA CCT AAA CCT CAC GGT 3，；gB-R :5’ -GTA GTC GAG CAG ACC CGT GTC-3’ ；TaqMan 探针5，-FAM-AGG ACC GCG AGT TCT TGC CGC-TAMRA-3，。采用TaqMan荧光PCR试剂盒(TAKARA公司产品)，25 μ L反应体系中加入 2 XMaster Mix 12. 5 μ L、样本核酸 5 μ L、ddH20 至 25 μ L。扩增条件为95°C预变性 5min， 95°C 15s,60°C 45s (收集信号)，45循环，观察扩增曲线和Ct值。同时采用BVDV的I1aqMan 荧光RT-PCR试剂盒进行BVDV检测，的牛蓝舌病病毒(BTV)套式RT-PCR方法进行检测，的牛白血病病毒(BLV)套式RT-PCR方法进行检测，的口蹄疫病毒(FMDV)荧光RT-PCR方法进行检测。反应体系均采用RT-PCR试剂盒或TaqMan荧光RT-PCR试剂盒，25 μ L反应体系中加入相应的2XMaster Mix 12. 5 μ L、样本核酸5 μ L、引物或探针、ddH20至25 μ L，按照文献要求的反应条件进行扩增和结果判定。牛鼻腔棉拭子样本用IBRV PCR和荧光PCR进行检测，发病牛的3、9、11号样品的PCR和荧光PCR检测结果均为阳性，其余样本均为阴性。所有牛鼻腔棉拭子样本用BTV、BLV、FMDV的套式RT-PCR或荧光RT-PCR检测，结果均为阴性。实施例三病毒分离，取IBRV PCR和荧光PCR阳性，腔棉拭子冲洗液混合后，加入双抗青霉素1000IU/mL、链霉素ΙΟΟΟμ g/mL，至37°C作用ai，2000g离心lOmin，取上清液接种于长满单层MDBK细胞的96孔板上，100 μ L/孔，加6孔。37°C吸附lh，倾去上清液，加入维持液(含青霉素200IU/mL、链霉素200 μ g本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．牛传染性鼻气管炎病毒毒株及制备方法和应用，其特征在于包括以下步骤：ａ、用无菌棉签提取发病牛鼻腔分泌物送实验室，得腔棉拭子样本；ｂ、以ｇＢ－１和ｇＢ－２为引物，用ＰＣＲ方法进行检测扩增，病料中扩增出特异性片段，以ｇＢ－Ｆ、ｇＢ－Ｒ为引物和探针，用ＰＣＲ和荧光ＰＣＲ方法检测扩增，鉴定传染性牛鼻气管炎病毒，检测结果均为阳性；ｃ、在ＭＤＢＫ细胞经培养基加经检测没有ＩＢＲＶ的牛血清，后培养一定时间，长成单层ＭＤＢＫ细胞，用ＰＣＲ和荧光ＰＣＲ方法检测的腔棉拭子样本接种于单层ＭＤＢＫ细胞，观察细胞病变，待７０％－８０％细胞出现病毒病变时，将细胞收入－４０℃冰箱保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金业，
申请(专利权)人：深圳市青珊瑚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94