本发明专利技术提供一种从人或动物多能干细胞提取间质性干细胞的方法及药物，该方法包括步骤：A.基于人或动物多能干细胞取样，利用酶类消化液对样品进行消化，其中所述酶类消化液包括中性蛋白酶和Ⅳ型胶原酶；B.在分离的单细胞中加入间质性干细胞条件培养液，进行细胞接种并培养；C.对培养后的细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。以解决现有技术中存在的间质性干细胞产出率较低、产量小、纯度低、衰老快和细胞批间质量不稳定的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学
，特别涉及一种从人或动物多能干细胞 (Pluripotent Stem Cell)提取间质性干细胞方法。
技术介绍
间质性干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一类具有多分化潜能及自我更新能力的组织干细胞，可以分化为多种组织细胞成骨、软骨、脂肪、血管、神经细胞等。间质性干细胞其最早自骨髓中分离出来，近年已有具有干/祖细胞特征的间质性细胞自骨髓、 外周血、密质骨、软骨、肌肉等组织分离出来。这些组织的共同特点是由来源于胚外中胚层的间充质和血管共同构成。在分化能力方面，间质性干细胞可分化为多种组织细胞成骨、 软骨、脂肪、血管、神经细胞等。在免疫特性方面，间质性干细胞体外不表达或仅表达可忽略水平的MHCII类分子，不相关供者的间质性干细胞不引起异体淋巴细胞反应，能下调异体免疫反应。由于具有上述特性，MSC自发现后即迅速成为细胞治疗、基因治疗等方面的理想工程细胞，以及组织工程尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细胞。目前报道的间质性干细胞主要来源于骨髓。骨髓中间充质干细胞含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0.001-0. 01%，并随年龄的增加而减少，因此，要利用骨髓间充质干细胞就必须实现其体外分离培养、扩增。供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，而在取材过程中及取材后会有很高的感染几率；另外，由于人体骨髓中间质性干细胞的含量极其稀少，每IO5 IO6个单个核细胞中大约只有1个间质性干细胞。另外，不同样本个体差异大，导致分离间质性干细胞质量差别很大，也难以进行良好的质量控制和疗效评估。重要的是，且随着年龄的增加，或合并感染、肿瘤等疾病，骨髓中间质性干细胞的数量以及增殖分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到很大限制。有的利用胚胎组织分离间质性干细胞，存在伦理争议，限制了其应用；有的从胎盘或脐带组织分离间质性干细胞，但用其异体治疗时的安全性和免疫排斥问题尚存争议。因此，需要一种新的间质性干细胞来源，能够迅速得到大量的、高纯度且高质量的间质性干细胞，还能实现其扩展应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种从人或动物多能干细胞提取间质性干细胞方法，以解决现有技术中存在的间质性干细胞产出率较低、产量小、纯度低、衰老快和细胞批间质量不稳定的问题。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案，其包括步骤A.基于人或动物多能干细胞取样，利用酶类消化液对样品进行消化，分离出的单细胞，其中所述酶类消化液包括中性蛋白酶和IV型胶原酶；B.在分离的单细胞中加入间质性干细胞条件培养液，进行细胞接种并培养；C.对培养后的细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。3优选地，所述步骤A中的酶类消化液包括中性蛋白酶l-10g/L和IV胶原酶 0. 25g//L 0. 75g//L。优选地，所述步骤A中的酶类消化液的制备包括将IOOml含0. Ig中性蛋白酶的DMEM/F12与IOOmml含0. Olg IV胶原酶的DMEM/ F12按照1 1的体积比混合。 优选地，所述间质性干细胞条件培养液，按照质量百分比，包括DMEM培养基人血血浆抗坏血酸抗生素和谷氨酰胺非必需氨基酸68-96%； 1-30%； 0.01-1%；1%； 1%； 0-0.1%。抗氧化剂优选地，所述步骤C中的贴壁纯化处理包括用移液管将未贴壁的细胞吸出，加入生理盐水清洗并换上新的间质性干细胞条件培养液继续培养，待贴壁细胞扩增到培养瓶的设定容积时用胰酶-EDTA消化，获得单细胞悬液。 优选地，所述步骤C中的磁珠分选包括采用免疫磁珠分离法，从所述单细胞中筛选出CDM阴性和CD90阳性的细胞群，即从人或动物多能干细胞分离出的间质性干细胞。一种药物，所述药物由从人或动物多能干细胞分离出的间质性干细胞(ESC/ iPSC-MSC)制成。通过实施以上技术方案，具有以下技术效果本专利技术提供从人或动物多能干细胞提取间质性干细胞方法，从人或动物多能干细胞诱导分化成间质性干细胞提取出间质性干细胞(ESC/iPSC-MSC)，与现有技术中的骨髓间质性干细胞比较，从人或动物多能干细胞来源的间质性干细胞不但具有很强的增殖分化能力，还解决了不同批间干细胞质量差别的问题，可以大量体外制备、冻存以供应将来自体或异体治疗时的应用。此外，从人或动物多能干细胞来源的间质性干细胞不存在伦理争议，可以大量体外制备、冻存以供应将来自体治疗时的应用并且无免疫排斥的风险。附图说明图1为本专利技术实施例提供的方法流程图。具体实施方式为了更好的理解本专利技术的技术方案，下面详细描述本专利技术提供的实施例。本专利技术实施例提供，如图1 所示，其包括步骤A、基于人或动物多能干细胞取样，该多能干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESC)和人工诱导的多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)等， 利用酶类消化液对取样的样品进行消化，其中所述酶类消化液包括中性蛋白酶和IV型胶原酶；B、在分离的单细胞中加入间质性干细胞条件培养液，进行细胞接种并培养；C、对培养后的细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。本实施例中，优选地，所述步骤A中的酶类消化液包括中性蛋白酶l-10g/L和IV胶原酶 0. 25g//L 0. 75g//L。优选地，所述步骤A中的酶类消化液的制备包括将IOOml含0. Ig中性蛋白酶的DMEM/F12与IOOmml含0. Olg IV胶原酶的DMEM/ F12按照1 1的体积比混合。本实施例中，优选地，所述间质性干细胞条件培养液，按照质量百分比，包括DMEM培养基人血血浆抗坏血酸抗生素和谷氨酰胺非必需氨基酸68-96%； 1-30%； 0.01-1%；1%； 1%；抗氧化剂0-0.1%。本实施例中，优选地，所述步骤C中的贴壁纯化处理包括用移液管将未贴壁的细胞吸出，加入生理盐水清洗并换上新的间质性干细胞条件培养液继续培养，待贴壁细胞扩增到培养瓶的设定容积时用胰酶-EDTA消化，获得单细胞悬液。 本实施例中，优选地，所述步骤C中的磁珠分选包括采用免疫磁珠分离法，从所述单细胞中筛选出CDM阴性和CD90阳性的细胞群，即从人或动物多能干细胞分离出的间质性干细胞。本专利技术实施例还提供一种药物，所述药物由从人或动物多能干细胞分离出的间质性干细胞制成。一 上述方法从人或动物多能干细胞提取的间质性干细胞制成的间质性干细胞药物在治疗免疫性疾病方面的应用间质性干细胞已经在临床前和临床中用于治疗多种心血管疾病，包括缺血性心血管疾病。人们认为它们的作用机制有两种。一是它们分化为功能正常的细胞，用以取代损伤细胞；二是它们可以通过旁分泌机制分泌细胞因子，促进组织修复。为了确定从人或动物多能干细胞提取间质性干细胞(ESC/iPSC-MSC)制成的药物比骨髓源间质性干细胞(BM-MSC) 制成的药物是否对缺血性心血管疾病有更好的治疗功能，通过把ESC/iPSC-MSC制成的药物或BM-MSC制成的药物注入小鼠下肢动脉缺血的体内进行了测评。分别把两种细胞注入下肢动脉缺血的组织周围，结果显示与BM-MSC制成的药物比较，ESC/iPSC-MSC制成的药物对下肢动脉缺血有更显著的保护作用。研究结果表明与B本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种从人或动物多能干细胞提取间质性干细胞的方法，其特征在于，包括步骤：Ａ．基于人或动物多能干细胞取样，利用酶类消化液对样品进行消化，分离出的单细胞，其中所述酶类消化液包括中性蛋白酶和Ⅳ型胶原酶；Ｂ．在分离的单细胞中加入间质性干细胞条件培养液，进行细胞接种并培养；Ｃ．对培养后的细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：连祺周，
申请(专利权)人：连祺周，
类型：发明
国别省市：35
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