环境颗粒物表面外源生物分子的原位检测试剂及方法技术

本发明专利技术公开了一种环境颗粒物表面外源生物分子的原位检测试剂及方法，本发明专利技术以检测土壤颗粒物表面吸附的杀虫蛋白Cry1Ab为目标，在磁性荧光纳米微球表明连接Cry1Ab蛋白抗体，将土壤颗粒物悬浊液与上述磁性荧光纳米微球孵育一段时间后，表面吸附有Cry1Ab蛋白的土壤颗粒物表面通过抗原抗体相互作用俘获上述磁性荧光纳米微球，通过磁分离后，将带有磁性的颗粒物悬浊液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计检测颗粒物产生的荧光信号。其荧光强度与土壤颗粒物表面吸附的Cry1Ab蛋白在一定范围内呈正比，据此可以直接定量颗粒物表面吸附的Cry1Ab蛋白。也可采用荧光显微镜及激光诱导荧光散射脉冲谱进行动态定量分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境检测
，尤其涉及一种环境颗粒物表面外源转基因蛋白的原位检测试剂及检测方法。
技术介绍
随着生物技术的发展和生物工程产业化的普及，某些具有生物活性的蛋白质，肽， 以及具有危害性的DNA分子进入环境的可能性越来越大。事实上，环境中的污染物并不仅仅局限于小分子有机和无机毒物，某些生物大分子同样是我们所面临的潜在污染物。这些在环境中并非固有存在的生物分子我们统称为外源生物分子(Extraneous Biomolecules, 简称EBM)，EBM的主要来源包括以下几种类型(1)通过基因工程技术生产的蛋白和多肽类药物，此类生物药物的生产已经进入了较高的产业化水平，环境暴露风险较高。虽然蛋白和多肽类药物对疾病具有治疗作用，但对正常人群的副作用不可避免。(2)转基因植物的大量种植，为外源基因(T-DNA)及其表达产物(外源活性蛋白)大量进入环境提供了条件。如转 Bt基因的玉米，棉花以及大米已经在世界范围内大量种植，其T-DNA及其表达蛋白通过根系分泌物以及桔杆还田过程被土壤颗粒物所吸附。另外通过转基因植物生产的蛋白类药物和疫苗也已经进入了试验阶段，一旦进入商业种植，各种外源活性蛋白在环境中的释放水平势必大大增加。上述EBM在环境中均主要以吸附态的形式存在于土壤颗粒、水体中的固相悬浮物，大气飘尘等各类环境固相介质并发挥着生物学效应。要正确判断EBM的环境风险，首先应明确固相表面吸附态EBM的存在，并对其定量分析。因此，开发环境颗粒物表面外源生物大分子的检测方法尤为重要。本专利技术以检测土壤颗粒物表面紧密吸附的杀虫蛋白 CrylAb为目标。通过该专利技术的实施可实现环境颗粒物表面吸附态CrylAb杀虫蛋白的快速检测。研究表明，CrylAb蛋白质一旦被蒙脱土、高岭土等微纳米级颗粒物吸附后，其提取率极小，甚至根本无法提取，或提取后在提取剂中失活，在随后对其它蛋白质的研究及相关报道中也有类似的结果。吸附于某些颗粒物表面的CrylAb蛋白虽然不能被提取和检测，却仍能保持相当的生物活性，发挥着一定的生物学效应。因此，如果不能对颗粒物表面吸附态生物分子进行原位检测，就不可能发现这些生物分子在环境中的存在，也不能判断其对环境产生的风险。然而对吸附态生物分子的检测与小分子污染物有着极大的不同，它们基本上不能依靠提取的方法将被测物转移至溶液相后进行测定。因此必须建立起颗粒物表面吸附态蛋白的原位检测技术。圆二色谱(CD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)，以及微量热法(DSC)，原子力显微镜(AFM)等技术虽然可以探测固体表面吸附的生物分子，但上述方法不适合于环境颗粒物表面低浓度生物分子的检测。环境颗粒物中吸附的生物分子其浓度通常在ng/g^g/g级别之间。而且，复杂的环境颗粒物本身的光谱信号会严重干扰生物分子的光谱信号。因此光谱学方法根本无法检测EBM在环境颗粒物表面的存在。免疫分析技术的发展为痕量蛋白质和DNA的检测提供了技术基础，然而环境微粒物对于免疫分析或DNA杂交分析中的底物分子，抗体的非特异性吸附极大，将严重干扰颗粒物表面吸附态被测生物分子所产生的特异性信号。因此要解决环境表面固相生物分子的定量检测，关键的问题是要消除环境颗粒物对生物分析过程中底物、抗体、DNA探针分子的非特异性吸附。目前，纳米微球作为生物分析探针的方法得到了迅速的发展。由于磁性纳米微球(MNP)在磁场的作用下能比较方便地从各类复杂试样介质中的分离出来，已经成为从复杂样品中捕获微量目标生物分子的重要方法，尤其对于存在于复杂溶液样品中的被测分子可以进行直接的捕获，然而用通常的MNP只能对被测物起到分离作用，本专利技术采用抗体偶联的荧光磁性纳米微球(FMNP)作为环境颗粒物表面生物分子的原位检测试剂，同时实现了分离与检测，大大简化了检测程序。FMNP能较好地渗入到颗粒表面的微孔结构中，并能触及表面微孔中的吸附态生物分子而发生相应的生化反应(如结合)，而与颗粒物表面不发生特异性结合的FMNP可在磁场中与结合有FMNP的颗粒物进行分离，并用荧光光度计对颗粒物表面产生的荧光信号进行检测。该方法有效地降低了非特异性信号，提高了原位分析的准确性和可靠性。本专利技术以土壤颗粒物表面吸附态CrylAb蛋白为检测对象，用FMNP及荧光光谱分析技术实现了颗粒物表面的CrylAb蛋白的原位检测。目前市场上并未见检测环境颗粒物表面吸附态蛋白质的原位检测试剂及方法，其他现有的免疫分析方法并不适用这种特殊应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种用于环境颗粒物表面外源生物分子的原位检测试剂，该试剂是一种荧光磁性纳米微球，磁性颗粒物表面修饰带有荧光基团的氨基多糖。进一步地，磁性颗粒物表面修饰的氨基多糖通过共价连接的方法连接各种有机荧光分子，如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明异硫氰酸酯等。进一步地，磁性颗粒物表面修饰的氨基多糖为壳聚糖，或部分乙酰化的壳聚糖，或壳聚糖的衍生物。进一步地，所述磁性纳米颗粒材料是Fe3O4，Fe2O3，其尺寸小于120nm。进一步地，所述荧光标记的氨基多糖与磁性纳米颗粒在聚阴离子的交联作用下形成纳米微球；且其能够用多种共价键合方式将针对外源生物分子的抗体固定在微球表面。一种应用上述原位检测试剂的原位检测方法，用检测试剂与吸附有外源生物分子的环境颗粒物混合，用磁场分离磁性物质，并在磁性通道内捕获结合有磁性荧光纳米微球的目标颗粒物，并用荧光分光光度计检测目标颗粒物的荧光强度。进一步地，光显微镜直接观察在磁性通道内带有荧光特征的颗粒物。进一步地，将磁分离后的颗粒物配置成悬浮液后，泵入毛细管通道，用激光器发射的激光聚焦后对准毛细管通道，在特定的角度用光电倍增管测量流经毛细管的颗粒物荧光发射光强度及散射光强度，并动态采集每个颗粒物流经毛细管通道后的荧光和散射光脉冲信号。本专利技术的有益效果是(1)荧光磁性纳米微球具有荧光和磁性的双重性质，对目标颗粒物同时具有分离捕获及检测的功能。(2)颗粒物表面吸附的外源转基因蛋白无需提取即可直接进行原位检测。(3)采用磁分离手段避免了荧光试剂及抗体在颗粒物表面的非选择性吸附。本专利技术在生命体系的超痕量分析，环境生物污染的原位检测等领域具有潜在的应用价值。附图说明图1是用于分离及观察被目标颗粒物捕获的荧光磁性纳米微球的装置结构示意图中，微通道1、PDMS薄膜2、硅片3、磁铁4、反射式显微镜物镜5、被捕获的目标颗粒物图像6。具体实施例方式本专利技术包括以下几个方面1、荧光磁性纳米微球的制备荧光磁性纳米微球的制备已经有大量的文献报道，本专利技术公开的荧光磁性纳米微球是一种表面被具有功能基的高分子包裹的铁磁性纳米微球，可方便地实现生物探针分子及荧光信号分子的偶联固定，且与高分子连接的荧光基团具有较高的稳定性。2、荧光磁性纳米微球在磁场作用下与不同尺度环境颗粒物的分离方法的建立纳米磁性微球作为探针用于颗粒物表面生物分子原位检测试剂的优越性就在于磁性微球容易与其它固相基质分离，从而大大降低固相基质与探针分子的非特异性吸附，提高原位检测的准确度。本专利技术提供了土壤颗粒物，荧光纳米磁性微球，及土壤颗粒物与荧光纳米磁性微球的磁分离方法。3、荧光磁性纳米微球与CrylAb抗体的偶联及颗粒物表面吸附态C本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于环境颗粒物表面外源生物分子的原位检测试剂，其特征在于，该试剂是一种荧光磁性纳米微球，磁性颗粒物表面修饰带有荧光基团的氨基多糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邬建敏，赵伟洁，唐艳艳，李臻，叶庆富，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86