一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，涉及一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法。本发明专利技术是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌风险的过高估计的问题。方法：一、受检乳样的前处理；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增；四、取LAMP扩增产物点样于琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中成像，即完成检测。本发明专利技术的方法检测灵敏度高，对金黄色葡萄球菌的最低检出限为100fg。可广泛应用于食源性致病菌检测领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年由日本荣研株式会社开发的一种简单、快速、特异、经济的新型核酸扩增技术，该方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4个特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下反应几十分钟即可完成。具有高特异性和等温扩增的特点，Ih之内可将靶基因扩增IO9 101°倍。在DNA延伸合成时，从脱氧核苷三磷酸基质(dNIPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生一种焦磷酸镁衍生物的白色沉淀，利用这一特点用肉眼即可判断扩增与否。环境中细胞失去生存能力后，其DNA依然具有持续生存能力，而基于传统的DNA检测方法不能区分阳性信号是来自靶微生物中的活细菌还是死细菌，无法有效区分死菌和活菌，可能导致对致病菌风险的过高估计或得出假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌风险的过高估计的问题，提供。本专利技术检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向ImL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3 μ g/mL,然后置于冰上暗处放置5 30min,接着置于距650W卤素灯15 20cm处，曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1 X TAE 电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。本专利技术针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)来设计引物，进行LAMP扩增。 本专利技术使用的荧光染料PMA(Propidium Monoazide)结构中带有一个叠氮基团(_N3)，在光激发下脱去(_拟)形成活跃的氮宾中间体，能插入死细胞DNA与其形成共价键(-NH-CH2-)， 使DNA不能发生扩增反应，从而抑制LAMP扩增，可以有效区分死细菌和活细菌，避免造成对待测样品中实际存活的金黄色葡萄球菌含量的错误评估。将本专利技术的电泳结果使用凝胶成像系统成像，能够检测出扩增条带的即说明受检乳中含有金黄色葡萄球菌。本专利技术的方法检测灵敏度高，对金黄色葡萄球菌的最低检出限为lOOfg。本专利技术为食品中致病菌的检测开辟了新思路。附图说明图1为具体实施方式十四的检测结果电泳图；图2为具体实施方式十四中PMA抑制金黄色葡萄球菌死菌的LAMP扩增结果电泳图；图3为具体实施方式十四中荧光染料STOR Green I验证LAMP反应的结果图；图4为具体实施方式十四灵敏度测试实验中LAMP扩增的电泳图；图5为具体实施方式十四灵敏度测试实验中PCR扩增的电泳图。 具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向IrnL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3μ g/mL，然后置于冰上暗处放置5 30min，接着置于距650W卤素灯15 20cm处，曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到 LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中， 以100V电压在IXTAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置5min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置30min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置10 20min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置15min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯15cm处。其它与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯18cm处。其它与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯20cm处。其它与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤一中曝光:3min。其它与具体实施方式一至八之一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤一中曝光細化。其它与具体实施方式一至八之一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤一中曝光5min。其它与具体实施方式一至八之一相同。具体实施方式十二 本实施方式与具体实施方式一至十一不同的是步骤二中所述对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取的方法为a、向步骤一处理后的受检乳中加入 ImL的DNA提取液、IOyL浓度为10mg/mL的蛋白酶K和10 μ L浓度为10mg/mL的溶菌酶，然后于37°C、200r/min条件下振荡1. 5h，再加入200 μ L质量浓度为20%的SDS，然后于65°C 水浴lh，之后以13000r/min的转速离心5min，取上清液；b、在沉淀中加入0. 75mL的DNA提取液和75 μ L浓度为20%的SDS，在涡旋振荡器上振荡IOs后，于65°C水浴20min，然后在室温下以13000r/min离心5min，取上清液；C、合并步骤a和步骤b得到的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，于13000r/min离心5min，回收水相，在水相中加入0. 6倍体积的4°C的异丙醇，在_20°C放置1.证，然后于13000r/min离心lOmin，弃掉上清液，将沉淀用4°C的体积浓度为70%的乙醇洗涤3 5次，干燥后加入300 μ L的TE缓冲液，即为提取物；步骤a和步骤b中所述DNA提取液由0. lmol/L的Tris-HCl、0. lmol/L的EDTA、0. Imo 1/ L的Νει3Ρ04、1. 5mol/L的NaCl和质量浓度为10A的CTAB组成，DNA提取液的pH值为8 ；步骤 c中氯仿和异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为M 1。其它与具体实施方式一至十一相同。具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式一至十二不同的是步骤三中 LAMP扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分模板40|imol/L 的引物 FIP 5，- GGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCATGTACAAAGGTCAACCAATG -3'40|imol/L 的引物 BIP 5，- AGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGCCTTTGTCAAACTCGACTTC -3ΙΟμιηοΙ/L 的引物 F3 5，- CGATTGATGGTGATACGGTTA -3‘ΙΟμιηοΙ/L 的引物 B35，- CCACGTCCATATTTATCAGTTC -3'IOxBst 酶 Buf本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行：一、受检乳样的前处理：向１ｍＬ受检乳中加入ＰＭＡ，使ＰＭＡ的浓度为３μｇ／ｍＬ，然后置于冰上暗处放置５～３０ｍｉｎ，接着置于距６５０Ｗ卤素灯１５～２０ｃｍ处，曝光３～５ｍｉｎ；二、对步骤一处理后的受检乳进行ＤＮＡ提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行ＬＡＭＰ扩增，得到ＬＡＭＰ扩增产物；四、鉴定：取５μＬ ＬＡＭＰ扩增产物，点样于质量浓度为２％的琼脂糖凝胶中，以１００Ｖ电压在１×ＴＡＥ电泳缓冲液中电泳３０ｍｉｎ，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。
【技术特征摘要】
1.一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向ImL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3 μ g/mL,然后置于冰上暗处放置5 30min，接着置于距650W卤素灯15 20cm处， 曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中，以100V电压在IXTAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。2.根据权利要求1所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于暗处放置5min。3.根据权利要求1或2所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于距650W卤素灯18cm处。4.根据权利要求3所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中曝光3min。5.根据权利要求4所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤二中所述对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取的方法为a、向步骤一处理后的受检乳中加入ImL的DNA提取液、10 μ L浓度为10mg/mL的蛋白酶K和10 μ L浓度为10mg/mL的溶菌酶，然后于37...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，卢雁，刘春波，胡惠秩，满朝新，蒋亚男，刘颖，杨士芹，郎友，董鑫悦，
申请(专利权)人：黑龙江省乳品工业技术开发中心，
类型：发明
国别省市：93
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