一种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法，包括如下步骤：将活化后的酿酒酵母菌株接种于含有纤维素水解液抑制剂的传代培养基中培养；将生长到稳定期的细胞分离后，再接种到相同的含有纤维素水解液抑制剂的新鲜传代培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为耐受多种抑制剂酵母菌株。利用本发明专利技术的方法获得耐受多种抑制剂酵母菌株，对纤维素水解液抑制剂的耐受性提高，生长性状稳定，从而实现水解液的原位脱毒。为推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种得到耐受多种抑制剂酵母菌株的方法。
技术介绍
能源一直是困扰世界各国经济和社会发展的重大问题，随着石油的贫乏，开发新的可代替能源成为各国学者关注的热点，生物能源更是受到广泛的关注和研究。生物乙醇作为可再生能源，具有污染性小，容易运输和贮藏的特点，在价格上也可与汽油相竞争，它是最有可能取代石油的新能源，同时在一定程度上可缓解能源危机，具有巨大的发展前景。 以淀粉类和糖类作为发酵材料，采用微生物法发酵生产乙醇是一项成熟的技术，但高昂的原料成本使其工业应用受到限制。以农作物桔秆为代表的木质纤维素类生物质具有廉价， 来源丰富，对环境污染小的特点，是未来燃料乙醇产业规模化发展公认的原料来源。但是在纤维素乙醇生产工艺中，只有有效的破坏木质纤维素的致密结构才能使纤维素原料高效的转化为可发酵糖类，因此纤维素原料在水解前一般需要进行预处理。但是广泛应用的一些化学预处理方法通常在高温高压的条件下进行，会伴随着产生一些抑制剂，如呋喃类、弱酸类、酚类等。这些抑制剂严重影响菌体的生长、乙醇的产率、生物量和细胞内正常的分子机能。作为乙醇生产的传统菌株——酿酒酵母，具有底物利用高效性，产物专一性和稳健性等优点，但是它对抑制剂环境敏感，被抑制作用明显。传统的脱毒步骤会增加生产的成本，所以获得天然的耐受性酵母菌株从而实现原位脱毒和乙醇高效发酵在纤维素乙醇研究领域具有重要的意义。目前获得耐受菌株的方法多是通过进化工程和基因工程。微生物的一个重要特性就是在压力环境下改变细胞内部的物理条件来适应抗性环境。已有文献报道酿酒酵母在遇到生长环境剧烈变化时，可以通过引发自身的应激响应机制，同时细胞内多种分子机制作出响应，如信号传导，基因表达调控和代谢调节等，从而使细胞对压力环境产生适应。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种获得耐受多种抑制剂的酿酒酵母菌株的方法。本专利技术的技术方案概述如下—种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法，其特征是包括如下步骤将活化后的酿酒酵母菌株接种于含有纤维素水解液抑制剂的传代培养基中培养；将生长到稳定期的细胞分离后，再接种到相同的含有纤维素水解液抑制剂的新鲜传代培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为耐受多种抑制剂酵母菌株。所述的纤维素水解液抑制剂为糠醛、苯酚和乙酸。所述糠醛在传代培养基中的含量为1. 04g/L-l. 3g/L，所述乙酸在传代培养基中的含量为4. 24g/L-5. 3g/L，所述苯酚在传代培养基中的含量为0. 4g/L_0. 5g/L。所述酿酒酵母菌为安琪酵母，BY4741或BY4743。利用本专利技术的方法获得耐受多种抑制剂酵母菌株，对纤维素水解液抑制剂的耐受性提高，生长性状稳定，从而实现水解液的原位脱毒。为推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要的意义。附图说明图1是安琪酵母在糠醛的含量为1. 3g/L，乙酸的含量为5. 3g/L，苯酚的含量为 0. 5g/L低糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图2是安琪酵母在糠醛的含量为1. 04g/L,乙酸的含量为4. Mg/L，苯酚的含量为 0. 4g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图3是安琪酵母在糠醛的含量为1. 3g/L，乙酸的含量为5. 3g/L，苯酚的含量为 0. 5g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图4是BY4741在糠醛的含量为1. 04g/L,乙酸的含量为 0. 4g/L低糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图5是BY4741在糠醛的含量为1. 04g/L,乙酸的含量为 0. 4g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图6是BY4741在糠醛的含量为1. 17g/L，乙酸的含量为 0. 45g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图7是BY4743在糠醛的含量为1. 04g/L,乙酸的含量为 0. 4g/L低糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图8是BY4743在糠醛的含量为1. 04g/L,乙酸的含量为 0. 4g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；图9是BY4743在糠醛的含量为1. 17g/L，乙酸的含量为 0. 45g/L高糖培养基中传代培养的前三代生长曲线；具体实施例方式下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术，并不对本专利技术作任何限制。下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1(以安琪酵母(SC)为出发菌在含有纤维素水解液抑制剂的低糖培养基中利用传代培养获得耐受菌)，包括如下步骤1.种子培养基和传代培养基的配制种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C灭菌20min。传代培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C灭菌20min，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为1. 3g/L，乙酸的含量为 5. 3g/L，苯酚的含量为0. 5g/L。2.传代培养将安琪酵母经接种于IOOmL种子培养基中，在30°C、150rpm培养10h。然后以OD6tltl =0. 1的初始菌体浓度接种于含有3L传代培养基的发酵罐中，于30°C、150rpm条件下培4. Mg/L，苯酚的含量为 4. Mg/L，苯酚的含量为 4. 77g/L，苯酚的含量为 4. Mg/L，苯酚的含量为 4. Mg/L，苯酚的含量为 4. 77g/L，苯酚的含量为养，使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中菌体的生长曲线。当菌体生长到稳定期时，将细胞分离然后以OD6tltl = 0. 1的初始菌体浓度接种到相同的新鲜传代培养基中，细胞进入稳定期后再将细胞离心然后以0D_ = 0. 1的初始菌体浓度接种到相同的新鲜传代培养基中，之后将稳定期细胞保存，即为耐受菌。3.实验结果如图1所示，安琪酵母经活化后接种到传代培养基(含有纤维素水解液抑制剂的低糖培养基)中，细胞的生长受到十分显著的抑制，第一轮的细胞经过约IOOh的延滞期后开始进入指数生长期，直到141h左右，细胞才逐渐进入稳定期。而将进入稳定期的菌株传代到新鲜的传代培养基时，菌株的延滞期大大缩短，仅他左右，同时生长速率明显加快，第二轮和第三轮的细胞都在Mh以内完成发酵左右进入稳定期。4.结论从上述实验结果可知，安琪酵母接种到传代培养基(含有纤维素水解液抑制剂的低糖培养基)中，生长受到明显的抑制，经过第一轮长时间的培养后，菌株对纤维素水解液抑制剂产生了一定的适应性和耐受性，在接下来的传代培养中，菌株对纤维素水解液抑制剂的抵抗能力明显增强，发酵时间明显缩短，并且从两种条件下第二轮和第三轮的发酵曲线可知，所获得菌株的对纤维素水解液抑制剂的耐受性较为稳定。所以以安琪酵母为出发菌株，可以利用该传代培养的方法能够获得耐受1. 3g/L糠醛，5. 3g/L乙酸和0. 5g/L苯酚的耐受菌。实施例2(以安琪酵母为出发菌在含有纤维素水解液抑制剂的高糖培养基中利用传代培养获得耐受菌)，包括如下步骤1.种子培养基和传代培养基的配制种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C灭菌20min。传代培养基1 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C灭菌20min，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为1. 0本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法，其特征是包括如下步骤：将活化后的酿酒酵母菌株接种于含有纤维素水解液抑制剂的传代培养基中培养；将生长到稳定期的细胞分离后，再接种到相同的含有纤维素水解液抑制剂的新鲜传代培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为耐受多种抑制剂酵母菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，王昕，李炳志，丁明珠，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12