本发明专利技术涉及病毒免疫学技术领域，具体涉及抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法及制备的抗体的用途，属于口蹄疫防控领域。本发明专利技术的可特异性分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8其微生物保藏号是：CCTCC?No:C201049。由该杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6B8产生单抗亚型为IgG1。本发明专利技术的杂交瘤细胞系可在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。本发明专利技术的单克隆抗体可在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒免疫学
，具体涉及抗0型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法及制备的抗体的用途，属于口蹄疫防控领域。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种严重危害偶蹄动物的烈性传染病。由于该病可引起幼畜死亡、动物生产性能下降、畜产品质量和数量降低，加之传播迅速，一经发生即给发病国家和地区造成巨大的经济损失，沉重打击对外贸易，因而该病曾一度被称为“政治经济性疾病”。作为一种世界范围内的重大动物疫病，口蹄疫一直是世界各国口岸检疫、防控监测的重要目标。目前，对于口蹄疫的检测诊断方法主要包括经典的病毒分离、PCR扩增病毒核酸和血清学检测，但是因为前两种方法需要动用病毒，因而需要配备相应级别的实验室， 同时还存在检测周期长的缺点。血清学方法因为回避了上述问题而获得了极大的发展。在各类血清学检测方法中，抗体作为其中的核心试剂，直接决定着检测方法的特异性和灵敏度。目前，虽然包括噬菌体展示、单链抗体等技术提供的抗体类型比以往更加丰富多样，但是口蹄疫检测中所采用的抗体仍以多克隆抗体和单克隆抗体为主，二者常被单独或结合使用。鉴于实验动物的个体差异，难于保证不同批次多克隆抗体水平的完全均一，单克隆抗体正凭借其特异、均勻和可无限供应的优势，被越来越多的研究者选用。自口蹄疫出现至今， 有关单克隆抗体的研究亦时有报道，但多属零散且缺乏系统性。这主要是因为单克隆抗体尽管具有上述诸多优点，但同时它也存在制备周期长、结果难以预知的缺点。此外，口蹄疫病毒的抗原结构极其复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原结构存在很大差异。这些都限制了口蹄疫单克隆抗体的研制。基于上述情况，积极开展口蹄疫完整的单克隆抗体库建设，不管对于口蹄疫的理论研究还是口蹄疫的现实防控都具有积极而重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株可特异性分泌抗0型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本专利技术的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞系分泌的抗口疫病毒的单克隆抗体；本专利技术的目的之三是将上述单克隆抗体用于诊断、预防和研究口蹄疫。本专利技术的一株能分泌抗0型口蹄疫病毒的血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8，其杂交瘤细胞株已于2010年5月11日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其微生物保藏号是CCTCC NO. C201049。本专利技术的一种抗0型口蹄疫病毒的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO :C201049的杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6B8产生，该抗体亚型为IgGl。本专利技术的杂交瘤细胞系可在制备诊断0型口蹄疫的试剂方面的应用。本专利技术的单克隆抗体在制备诊断0型口蹄疫的试剂方面的应用。现有技术中口蹄疫单克隆抗体的制备多采用完整病毒或人工表达的病毒某一片段为免疫抗原，再采用病毒筛选的方法来制备，由此带来的后果就是获得的单克隆抗体难于直接确定其识别的抗原表位，必须经过一系列的后期鉴定方可确知，这无疑增加了单克隆抗体的工作量和制备周期。近些年，随着口蹄疫病毒抗原位点的一一揭示，人们对于口蹄疫病毒中诱发免疫保护的关键位点越来越明确。同时，伴随着肽合成技术的发展，研究者已经可以按照自己的意愿合成目标蛋白肽段。综合上述种种情况，本专利技术设计了以蛋白短肽为免疫原，合成肽、载体和病毒三者同时筛选的单克隆抗体制备程序。该设计的优势在于 ①以蛋白短肽为免疫抗原，不需要进行病毒培养、纯化、标定、蛋白表达等以病毒和表达产物做抗原时带来的一系列实验操作，从而大大节省前期抗原准备时间；②合成肽、载体和病毒三者同步筛选，只有同时与合成肽和病毒结合而又不与载体结合的杂交瘤细胞才被筛选出来，既排除了误筛与载体结合的杂交瘤细胞，又保证了与病毒具有结合力的杂交瘤细胞的获得；③以蛋白短肽为免疫抗原，蛋白序列可以预先设定，间接限定了制备抗体的识别位点，进而省略了抗原表位的鉴定。本专利技术的口蹄疫单克隆抗体的制备周期缩短、制备流程简化，从而大大便利了口蹄疫单克隆抗体的研制。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现首先，对口蹄疫病毒VPl序列分析，选定用作免疫抗原的片段，通过肽合成技术人工合成目标片段，为增加其免疫原性，在其末端连接载体蛋白KLH ；为充分展示抗原位点，在远离抗原区域的一侧进行载体连接；为获得良好连接效果，在合成肽载体连接一端引入一个半胱氨酸。其次，在制定免疫程序时，本专利技术采用小剂量OOug/次/小鼠)免疫策略，以提高特异性强、效价高的杂交瘤的获得率；再次，采用合成肽、载体蛋白、病毒同步筛选方案，有力确保筛选的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与病毒的结合力。最后，在抗0型口蹄疫病毒单克隆抗体制备中，本专利技术主要采用体内诱生法的活体采集法，即待小鼠腹水产生后在保证其存活状态下采集，然后继续培养至腹水产生后再次收集如此反复直至不再有腹水产生或者小鼠死亡。该方案既保证了最大限度的腹水收率，又获得了更高的腹水效价。具体实施例方式根据本专利技术的目的和内容，实施例分成三部分完成。实施例一分泌抗0型口蹄疫病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8的建立；实施例二 抗0型口蹄疫病毒的单克隆抗体(以下命名为mab-6B8)的制备及其特性分析；实施例三抗0型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的用途。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一分泌抗0型口蹄疫病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8的建立(一)抗原制备通过文献报道和生物学软件对不同血清型口蹄疫病毒基因组VPl序列分析，选择该片段上0型口蹄疫特异、线性、中和性抗原位点的关键区段，合成一条包含观个氨基酸的短肽 SSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPC-KLH (SEQ ID NO 1),为提高短肽的免疫原性，在其末端连接载体血蓝蛋白(KLH，购自Sigma公司)。为保证短肽的良好结构，充分暴露其携带的抗原位点，在载体与短肽连接时在二者之间引入一个半胱氨酸。经质谱和液相色谱检测， 上述所得的肽合成物获得93%以上的纯度，适于用作免疫抗原。1)动物免疫取6-8周龄SPF级BALB/c小鼠4只，免疫前一天眼底采血，分离血清用作阴性对照。首次免疫将口蹄疫合成肽的KLH连接物用灭菌PBS溶解，与福氏完全佐剂(购自Sigma 公司)等体积混合皮下多点注射小鼠，每只小鼠20ug，即300ul/只。间隔两周后，等量抗原与福氏不完全佐剂(购自Sigma公司)等体积混合腹腔注射进行第二次免疫。两周后同法进行第三次免疫，一周后小鼠尾静脉采血测抗体效价。选取抗体效价最高者于融合前三天， 以20ug抗原剂量不加佐剂腹腔注射加强免疫。2)细胞融合(1)骨髓瘤细胞的准备B细胞融合技术中的骨髓瘤细胞均来自于本动物。鼠源骨髓瘤细胞主要有X-63、NS-I和SP2/0三种，又以SP2/0最为常用，本专利技术即选用该细胞作为单克隆抗体制备的骨髓瘤细胞。以含10%进口优级胎牛血清(PAA，购自西班牙Nalgene 公司)的1640培养基(Nissui，购自日本日水制药株式会社)于融合前两周复苏SP2/0细胞，并调整状态使其处于对数生长期，于融合前36-48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，并提高其培养基的血清浓度至15%。融合当天，先用1640基础培养基将骨髓瘤细胞洗涤两次， 然后用弯头滴管将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。lOOOr/min离心10本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株能分泌抗Ｏ型口蹄疫病毒的血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系６Ｂ８，其特征是微生物保藏号是：ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｃ２０１０４９。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，张杰，马丽娜，陈豪泰，周建华，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62
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