本发明专利技术提供了一种花粉特异性启动子及其应用。该启动子来源于白菜型油菜(Brassica?rapa)，是一个Δ8鞘脂脱氢酶基因的上游序列。本发明专利技术的启动子是一个稳定的特异性高的花粉特异性启动子。利用本发明专利技术的启动子可以在花粉中启动表达各种基因，可用于培育雄性不育作物品种和培育消除或大幅度减少花粉的园林绿化植物等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物花粉特异性启动子及其应用。具体地，涉及一个Δ8鞘脂脱氢酶基因启动子的获得和植物表达载体的构建，以及其在培育植物雄性不育系、花粉消除或大幅度减少的园林绿化植物中的应用。
技术介绍
在高等植物的发育过程中，雄配子的发育是个非常复杂的过程，其调控机制十分复杂。它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化，同时伴随着大量基因的协同表达。在花粉发育过程中，大约涉及20000种基因的表达，其中大约10%为花粉特异表达 ，而花粉特异表达的启动子对于这些基因在花粉中的特异表达起到了十分重要的作用。启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列。启动子通常位于基因上游，是基因表达调控的重要元件，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。组织特异性基因的启动子对该基因的组织特异性表达起重要作用。利用杂种优势可以显著的提高作用的产量，改善其品质。近十几年来，杂种优势育种已成为许多作物的主要育种方法。杂交繁育是传统的将两种植物的所需遗传性状导入一种植物以培育植物新品种的方法。无论对于自花授粉作物或异花授粉作物杂交，为了获得可靠的性状一致的杂种，应确保亲本系之一为雄性不育。产生雄性不育目前有多种技术，一种方法是人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗状雄花，该植物只有通过雄性亲本的花粉才具有可育性，然而该方法费时费力而且不完全可靠。另外一种方法是利用化学去雄制种，即选用某种化学药剂，在植物生长发育的某一时期喷洒母本，直接杀伤或抑制雄性器官及花粉，造成生理雄性不育，以达到去雄的目的。但这种方法因去雄不彻底，易受环境影响，效果不稳定，或价格太昂贵等，在应用上也受到限制。基因工程提供了另一种替代方法，来获得植物雄性不育系。例如在花药或花粉特异表达损害细胞的基因，导致花粉败育，从而获得雄性不育系。转基因雄性不育及其恢复的一个关键是花药或花粉特异表达的启动子，花药或花粉特异表达启动子可以直接驱动人工雄性不育基因在花粉或花药中特异表达而对雌蕊和其它器官没有影响。对于花粉特异性启动子的研究不仅有助于在理论上研究花粉发育过程中基因表达的调控机制，而且为创造植物转基因雄性不育奠定了基础。目前仅从番茄、 矮牵牛、玉米、烟草、金鱼草_、拟南芥、小麦和大小麦、水稻等少数植物中分离鉴定了花粉特异表达的启动子。利用花药或花粉特异的启动子通过基因工程创造雄性不育的方法主要有以下几种1，借助编码细胞毒素基因的特异表达导致植物的雄性不育。例如，Zhan等利用水稻花粉特异表达的启动子与核糖核苷酸酶基因Barnase连接构建嵌合基因转化烟草，得到了雄性不育的转基因植株。2，利用反义RNA技术获得雄性不育植株。Van der Meei^fchsA 基因的反义RNA基因与花药特异表达的启动子串联，转化矮牵牛得到了雄性不育的矮牵牛植株。3，通过提早降解胼胝质获得雄性不育植株。Worrall等将经过修饰的β_1，3_葡聚糖酶基因与拟南芥绒毡层特异表达的启动子A3和A9重组，使转基因植株在减数分裂时期表达过量的β_1，3-葡聚糖酶，从而出现了不同程度的雄性不育现象。在这些方法中，第一种方法的应用最为广泛，而其中用的几乎都是细胞毒素基因Barnase基因，该基因已在水稻、烟草、小麦、玉米和油菜等植物上得到了应用。油菜(芸苔属，十字花科)是世界上最重要的油料作物之一，通过分离油菜花药或花粉特异性启动子来创建雄性不育系进行杂种优势利用是提高油菜产量和品质的有效方法之一，该方面研究不仅有助于深入理解启动子调控油菜中基因转录的调控机制及花药或花粉特异表达方式的本质，同时更重要的是其潜在的巨大农业生产价值。对于芸苔属花粉特异性启动子的研究鲜有报道，目前仅有Dzelzkalns等研究发现芸苔属SLG基因上游序列的两个区域(-415到-291和-117到-8)具有启动花粉特异性表达的活性。白菜型油菜Δ8-鞘脂脱氢酶基因BrDSB是一种花器官特异性表达的基因，我们进一步证实BrDSB基因的启动子为花粉特异性表达的启动子，且特异性强，它的获得为通过基因工程的方法获得植物雄性不育创造了有利条件，为外源基因(对花粉或花粉生成有影响有基因)在花粉中特异性表达提供基础。理论上，将此启动子与细胞毒素基因如Barnase 基因或花粉发育的重要基因如chsA(查耳酮合成酶)基因的反义基因相连构建载体转化植物都可得到雄性不育转基因植物。另外，利用此方法获得雄性不育在培育无花粉或花粉显著减少的园林绿化植物上也具有潜在的应用价值，这可能对花粉过敏症有一定的缓解作用。因此，对于花粉特异性表达启动子的研究具有很大的应用价值。白菜型油菜Δ8-鞘脂脱氢酶基因BrDSB启动子的序列和功能尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一个花粉特异性表达启动子proBrDSB，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，这个启动子来源于白菜型油菜(Brassica rapa)的DNA片段，该启动子大小1292bp。本专利技术还提供了一种花粉特异性表达的载体，其特性在于转入了前述的白菜型油菜花粉特异性表达的启动子。利用前述的白菜型油菜特异性表达的启动子置换植物表达载体PBI121上的CaMV35S启动子，构建成在启动子下游含有GUS基因的新的植物表达载体， 命名为pBI-ProBrDSB。通过真空渗透法转化模式植物拟南芥，成功获得转基因植株。GUS 组织化学染色鉴定BrDSB基因的启动子为花粉特异性表达的启动子，PBI-ProBrDSB为一种花粉特异性表达的载体。本专利技术的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化， 微注射，电穿孔等方式导入植物细胞。可使用本专利技术的方法转化的植物宿主选自由烟草、小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、 向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物组成的组。本专利技术提供的花粉特异性表达的启动子及其植物表达载体，可应用于利用基因工程的方法获得植物尤其是油菜雄性不育系以及培育无花粉或花粉大量减少的园林绿化植物等方面。具体地，一方面，本专利技术提供花粉特异性启动子，其特征在于它的核苷酸序列是(a)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。另一方面，本专利技术提供含有权利要求1所述的启动子的表达盒。优选地，所述的表达盒特征在于所述花粉特异性启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。优选地，所述花粉特异性启动子的下游连接Barnase基因、花粉发育的重要基因如ChsA基因的反义基因等。另一方面，本专利技术提供含有上述启动子的重组表达载体，其特征在于转入了上述的花粉特异性表达的启动子。另一方面，本专利技术提供含有上述表达盒的重组表达载体。优选地，所述的重组表达载体特征在于是由权利要求2或3所述的表达盒与质粒、病毒或转运载体所构建的重组载体。更优选地，所述的重组表达载体为双元载体或共合载体。另一方面，本专利技术提供宿主细胞，其包含上述任一方面的重组表达载体。另一方面，本专利技术提供所述的花粉特异性启动子在培育植物雄性不育系、花粉消除或大幅度减少的植物中的应用。优选地，所述植物是油菜、拟南芥、烟草、玉米、水稻、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻和花生。另一方面，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．花粉特异性启动子，其特征在于：它的核苷酸序列是：（ａ）序列表中序列１所述的核苷酸序列；或（ｂ）与（ａ）所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，李书粉，宋丽英，尹维波，陈宇红，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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